江蘇部分集約化養(yǎng)殖場(chǎng)肉羊隱孢子蟲(chóng)分子流行病學(xué)調(diào)查及其蟲(chóng)種鑒定

蔡源，曹思宇，2，成大榮，3*，邢華，3*

（1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2．江都區(qū)小紀(jì)鎮(zhèn)人民政府，江蘇揚(yáng)州 225009；3．江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium）是一種經(jīng)糞-口途徑傳播 的人畜共患寄生蟲(chóng)，是導(dǎo)致腹瀉的4種病原體之一[1]。隱孢子蟲(chóng)可通過(guò)人與動(dòng)物的直接接觸或攝入污染的食物和水傳播[2]，感染宿主范圍廣泛，包括人、牛、羊、嚙齒類(lèi)及馬科動(dòng)物等[3]。隱孢子蟲(chóng)可引起免疫力低下的羔羊和犢牛出現(xiàn)長(zhǎng)期腹瀉，影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至危及生命[4]。

目前已知的隱孢子蟲(chóng)有38種，感染羊的隱孢子蟲(chóng)有微小隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium parvum）、泛在隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium ubiquitous）、安氏隱孢 子蟲(chóng)（Cryptosporidium andersoni）、費(fèi) 氏隱 孢 子蟲(chóng)（Cryptosporidium fayeri）、肖氏隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium xiaoi）、牛隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium bovis）、豬隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium suis）和人隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium hominis）等8種[5]。本研究通過(guò)采集部分集約化養(yǎng)殖場(chǎng)的肉羊糞便樣品，以分子生物學(xué)技術(shù)調(diào)查隱孢子蟲(chóng)的感染現(xiàn)狀，為該地區(qū)肉羊隱孢子蟲(chóng)病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

在江蘇省8個(gè)地區(qū)的肉羊養(yǎng)殖基地采集6～12月齡肉羊的新鮮糞便樣品，共采集446份樣品，其中腹瀉羊樣品168份，健康羊樣品278份，4℃冷藏保存。

1.2 試劑與儀器

糞便基因組DNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）、Premix Taq（TaKaRa Taq version 2.0 plus dye）、DL 2 000 DNA Marker（TaKaRa公司）。

BIO-RAD凝膠成像儀、T100?thermal cycler PCR儀、Power Pac basic電泳儀（BIO-RAD公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山羊糞便基因組DNA提取按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，提取糞便樣品的DNA。

1.3.2 引物合成（見(jiàn)表1）

參照張龍現(xiàn)等[6]報(bào)道的隱孢子蟲(chóng)18S rRNA基因設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，引物由華大基因合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 巢式PCR擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)引物信息Tab.1 PCR amplification of Cryptosporidium primers

1.3.3 隱孢子蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查

運(yùn)用巢式PCR的方法，基于18S rRNA基因引物對(duì)隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行擴(kuò)增，目的片段約為830 bp。

反應(yīng)體系：Premix TaqTM 12.5 μL、F1 1 μL、F2 1 μL、DNA模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。

PCR反應(yīng)條件見(jiàn)圖1。

圖1 隱孢子蟲(chóng)18S rRNA基因位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件Fig.1 PCR reaction condition of 18S rRNA gene of Cryptosporidium

取5 μL第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠孔中電泳，以DL 2000 DNA Marker為參照，采用凝膠成像系統(tǒng)采集拍照，記錄陽(yáng)性感染情況。

1.3.4 隱孢子蟲(chóng)卵囊形態(tài)觀(guān)察

將1.3.3巢式PCR篩選出的陽(yáng)性糞樣，經(jīng)260目網(wǎng)篩過(guò)濾，濾液以3 000 r/min離心10 min，收集沉淀。采用改良抗酸染色法鏡檢：取少許沉淀液涂片，空氣中自然干燥后采用甲醛固定；干燥后滴加苯酚品紅染液，10 min后緩慢沖洗；再滴加10%硫酸溶液脫色10 min，緩慢沖洗；最后滴加孔雀綠溶液復(fù)染8 min，沖洗干燥后鏡檢。

1.3.5 隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定

使用DNA膠回收試劑盒對(duì)巢式PCR陽(yáng)性條帶進(jìn)行回收，送至通用生物系統(tǒng)有限公司，進(jìn)行雙向測(cè)序。將樣品測(cè)序得到的結(jié)果在GenBank上用BLAST搜索比對(duì)校正，并將檢測(cè)所得的參考序列用DNAStar軟件進(jìn)行分析，確定分離的隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)型。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉羊隱孢子蟲(chóng)感染情況（見(jiàn)圖2）

圖2 隱孢子蟲(chóng)18S rRNA基因PCR擴(kuò)增部分結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of Cryptosporidium 18S rRNA gene

由圖2可知，經(jīng)巢式PCR檢測(cè)，446份樣品中有20份在18S rRNA基團(tuán)位點(diǎn)擴(kuò)增出大小約為830 bp的目的條帶。結(jié)果顯示，被檢樣品的隱孢子蟲(chóng)總感染率為4.48%（20/446），其中健康羊糞樣的陽(yáng)性檢出率為2.28%（8/278），腹瀉羊檢出率為7.14%（12/168）。

2.2 不同地區(qū)肉羊隱孢子蟲(chóng)的感染情況（見(jiàn)表2）

由表2可知，灌云、海門(mén)、高郵和啟東隱孢子感染率分別為6.25%、4.83%、22.42%和2.56%，淮安市、常州市、徐州市和泰州市4地采集的樣品中均未檢出隱孢子蟲(chóng)。

表2 不同地區(qū)肉羊隱孢子蟲(chóng)感染情況Tab.2 Cryptosporidium infection of mutton goat in different areas

2.3 不同肉羊品種隱孢子蟲(chóng)的感染情況（見(jiàn)表3）

由表3可知，3種不同的肉羊品種隱孢子蟲(chóng)的感染率也不相同，其中，睢寧白山羊和波爾山羊的隱孢子蟲(chóng)感染率分別為6.83%和5.83%，小尾寒羊暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(chóng)的感染。

表3 不同肉羊品種隱孢子蟲(chóng)的感染情況Tab.3 Infection of Cryptosporidium in different mutton sheep breeds

2.4 隱孢子蟲(chóng)卵囊形態(tài)鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖3）

圖3 檢測(cè)的隱孢子蟲(chóng)卵囊Fig.3 Detection of Cryptosporidium oocysts

由圖3可知，經(jīng)改良抗酸染色法染色后的隱孢子蟲(chóng)卵囊在油鏡下觀(guān)察，呈深玫瑰紅色，背景為藍(lán)綠色，卵囊壁輪廓清晰不著色，卵囊呈卵圓形或圓形，大小為5～6 μm，符合隱孢子蟲(chóng)的形態(tài)特征。

2.5 被檢樣品蟲(chóng)種鑒定結(jié)果（見(jiàn)表4）

由表4可知，20份隱孢子蟲(chóng)核酸陽(yáng)性樣品，經(jīng)測(cè)序分析后共發(fā)現(xiàn)2種隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種，分別為微小隱孢子蟲(chóng)和泛在隱孢子蟲(chóng)。其中灌云為泛在隱孢子蟲(chóng)；高郵和啟東均為微小隱孢子蟲(chóng)；海門(mén)既有泛在隱孢子蟲(chóng)又有微小隱孢子蟲(chóng)。將測(cè)得基因在Genbank上用Blast比對(duì)，均可匹配到同源性100%的蟲(chóng)種序列。

表4 被檢樣品蟲(chóng)種鑒定結(jié)果Tab.4 Species types of Cryptosporidium in tested samples

3 討論

隱孢子蟲(chóng)病是一種宿主范圍廣泛的人畜共患寄生蟲(chóng)病[7]，被WTO列為人類(lèi)最常見(jiàn)的6種腹瀉病之一[8]。隱孢子蟲(chóng)病可引起人和動(dòng)物的胃腸道紊亂，導(dǎo)致腹瀉、發(fā)熱、消瘦、嘔吐以及生長(zhǎng)發(fā)育緩慢等臨床癥狀，對(duì)肉羊舍飼造成了巨大損失[9-10]。由于隱孢子蟲(chóng)病尚無(wú)特效藥物治療和有效的疫苗預(yù)防，故做好隱孢子蟲(chóng)病的早期診斷對(duì)其防控具有重要的公共衛(wèi)生意義。本試驗(yàn)采用巢式PCR方法，輔以抗酸染色法，對(duì)江蘇部分地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了肉羊隱孢子蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查，以期為此病的防控工作提供參考。

本次試驗(yàn)基于18S rRNA以巢式PCR法檢測(cè)糞便樣品，隱孢子蟲(chóng)總感染率為4.48%，鑒定出微小隱孢子蟲(chóng)和泛在隱孢子蟲(chóng)2種隱孢子蟲(chóng)，泛在隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為2.47%（12/446），微小隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率為2.02%（8/446），兩者感染率接近。因此，分析認(rèn)為江蘇地區(qū)存在隱孢子蟲(chóng)的感染，其中灌云、海門(mén)、高郵和啟東隱孢子感染率分別為6.25%、4.83%、22.42%和2.56%，提示肉羊隱孢子蟲(chóng)病流行情況可能存在著地區(qū)差異性。經(jīng)分析，地方品種小尾寒羊和睢寧白山羊的感染率和外來(lái)品種波爾山羊差異不大，提示隱孢子蟲(chóng)感染率的差異可能與肉羊的飼養(yǎng)管理、品種、診斷方法、驅(qū)蟲(chóng)程序、樣品采集等有關(guān)[11]。

本次調(diào)查采樣中腹瀉羊樣品感染率為7.14%，健康羊樣品感染率為2.28%，可能與動(dòng)物的機(jī)體抵抗力有關(guān)。隨著養(yǎng)殖場(chǎng)規(guī)模化養(yǎng)殖的普及以及開(kāi)展科學(xué)有效的寄生蟲(chóng)防控措施，降低了動(dòng)物重復(fù)感染的概率。本次調(diào)查的羊群年齡未6～12月齡，營(yíng)養(yǎng)狀況較好，感染率較低。有研究認(rèn)為，分娩前后母羊和2～3月齡羔羊感染率較高，表明肉羊隱孢子蟲(chóng)病的感染與動(dòng)物的年齡、免疫情況以及機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)水平有關(guān)[12]。

隱孢子蟲(chóng)主要經(jīng)過(guò)水源傳播，通過(guò)攝入被隱孢子蟲(chóng)卵囊污染的水感染人或動(dòng)物。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)預(yù)防，注意飼養(yǎng)管理，保持環(huán)境衛(wèi)生，對(duì)圈舍進(jìn)行定期消毒，保持圈舍干燥干凈，做好糞便處理工作，避免污染水源[13]。隱孢子蟲(chóng)卵囊對(duì)環(huán)境和消毒劑的抵抗力很強(qiáng)，可采用50%氨水5 min，30%過(guò)氧化氫30 min，10%甲醛120 min對(duì)所有物體及其表面進(jìn)行蒸汽消毒[14]。此外，日常可采用增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力的保守治療方法，采用煮沸1 min以上的方法及濾孔直徑不超過(guò)1 μm的家用凈水器可確保飲水安全[15]。

目前對(duì)隱孢子蟲(chóng)感染尚無(wú)完全有效的治療方法，本試驗(yàn)運(yùn)用的隱孢子蟲(chóng)巢式PCR檢測(cè)方法不僅增加了普通PCR的特異性，而且比普通PCR反應(yīng)更敏感，重復(fù)性更好，可應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)江蘇省不同地區(qū)肉羊養(yǎng)殖場(chǎng)隱孢子蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肉羊養(yǎng)殖場(chǎng)存在隱孢子蟲(chóng)的感染，檢測(cè)到的2種病原均為人畜共患病原，不僅會(huì)造成肉羊經(jīng)濟(jì)的損失，對(duì)公共衛(wèi)生也具有潛在威脅。因此，肉羊場(chǎng)隱孢子蟲(chóng)病的防控仍需持續(xù)加強(qiáng)。