雞馬立克氏病病毒和疫苗毒株PCR診斷方法的建立及其應用

周冬玉，李國紅，靳澤華，徐巧霞，徐蓉，張安定，5*

（1．華中農業大學動物醫學院農業微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430070；2．湖北省預防獸醫學重點實驗室生豬健康養殖協同創新中心，湖北武漢 430070；3．農業農村部獸醫診斷制劑創制重點實驗室，湖北武漢 430070；4．武漢科前生物股份有限公司，湖北武漢 430070；5．科技部動物疫病聯合研究中心，湖北武漢 430070）

馬立克氏病（MD）是由馬立克氏病病毒（MDV）引起的一種高度傳染性淋巴組織增生性腫瘤病，發病率和病死率均較高。MDV是一種嚴格的細胞結合型病毒，可根據血清學反應分為MDV-Ⅰ型、MDV-Ⅱ型、MDV-Ⅲ型，但只有Ⅰ型具有致病性[1-2]。20世紀70年代，國際上開始采用火雞皰疹病毒（HVT）苗預防MD[3]；20世紀80～90年代起，MDV開始朝毒力更強的方向進化[4]，MD的疫苗也隨之增加。但超強毒株突破了CVI988以及814疫苗毒株的保護力造成免疫失敗[5]，造成多種病原的繼發及共同感染。因此，及時診斷對MD防控具有重大意義。

MDV是雙鏈DNA分子，基因組約180 kb，由2個單鏈環通過一個雙鏈臂連接而成，包括末端長短重復序列以及內部長短重復序列[6]。MDV基因組上功能區域可分為主要致瘤基因meq[7]、與毒株毒力相關的132-bp重復序列[8]、與免疫抑制相關的pp38/pp24磷蛋白基因[9]、與免疫逃避相關的v-il8基因[10]以及1.8 kb基因家族[9-11]；與誘導免疫應答相關的糖蛋白基因gB、gC、gD、gE等；尚未闡述清楚功能的其他基因。運用CRISPR/Cas9基因編輯技術[12]、黏粒和BAC克隆等技術[13]構建的meq基因缺失毒株的致瘤性明顯減弱，表明meq基因作為致瘤基因在MDV腫瘤形成發展過程中具有至關重要的作用[14]。試驗對Gen Bank發表的140余株MDV序列進行全基因組比對，選定MDV-Ⅰ型特有的meq基因設計1對引物，通過優化退火溫度等條件建立了MDV-Ⅰ的PCR診斷方法，評估該方法的特異性、靈敏度及重復性，以期為MD的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MD病死雞的肝組織分離自某雞場。

MDV-Ⅰ型毒株、CVI988、814疫苗毒株均由武漢科前生物股份有限公司饋贈。HVT、雞傳染性貧血病毒（CIAV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）、禽白血病病毒（ALV）、雞包涵體肝炎病毒（IBHV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、雞胚成纖維細胞（CEF）均由本實驗室保存。

EasyTaq?DNA Polymerase（北京全式金生物技術有限公司）；DNAiso Reagent試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）。

1.2 引物設計與合成

根據全基因組比對以及Gen Bank上發表的meq基因設計1對引物meq-F及meq-R，引物由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.3 PCR擴增

1.3.1 樣品基因組制備

復蘇CEF細胞，將MDV接種于CEF細胞，待細胞病變約為70%時收取細胞，采用DNAiso Reagent試劑盒提基因組。取部分疑似MD病死雞的肝組織，剪碎成米粒大小的組織塊，提取基因組的同時提取CVI988、814、CIAV、IBV、IBDV、ALV、IBHV、IAV、NDV、CEF細胞基因組。

1.3.2 PCR診斷方法的建立

擴增體系（總體積為25 μL）：以1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株以及CVI988、814、HVT疫苗毒株基因組為模板，各 取1 μL；EasyTaq?-DNA Polymerase 0.5 μL、10×EasyTaq?-buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L）。

擴增程序：單蒸水補足至總體系為25 μL，設置35個循環數，95℃預變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火5 s，72℃延伸30 s，循環35次；72℃延伸10 min，4℃保存。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析以及測序分析。

1.3.3 PCR特異性試驗

采用1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、CIAV、IBV、IBDV、ALV、IBHV、IAV、NDV、CEF基因組為模板，運用確定的反應條件進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，評估其特異性。

1.3.4 PCR敏感性試驗

將1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、CEF基因組進行NANO DROP定量，調整至終濃度為10 g/mL后，做10倍比稀釋，連續稀釋5個梯度為模板（10.000、1.000、0.100、0.010、0.001 g/mL），以反應條件進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，判斷其敏感性。

1.3.5 PCR重復性試驗

將1.3.1中的MDV-Ⅰ型毒株、CVI988、814疫苗毒株、CEF基因組進行PCR檢測，每個模板設置3次重復，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，評估穩定性。

1.3.6 對1例疑似免疫失敗雞的檢測

以MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、疑似MD病死雞肝組織基因組、CEF基因組為模板，運用確定的PCR條件進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后送測序判斷檢測結果。

2 結果與分析

2.1 PCR診斷方法（見圖1～圖3）

由圖1可知，MDV-Ⅰ型毒株基因組擴增得到286 bp條帶，CVI988、814疫苗毒株擴增得到463 bp條帶，HVT疫苗毒株未擴增出相應條帶。

圖1 MDV PCR診斷方法Fig.1 Diagnostic method of PCR for MDV

將擴增條帶送測序，測序結果顯示MDV-Ⅰ型毒株擴增條帶與MDV-Ⅰ型毒株基因序列匹配（見圖2）；疫苗毒株擴增條帶與疫苗毒株基因序列匹配（見圖3）。

圖2 MDV-Ⅰ測序結果Fig.2 Sequence results of MDV-Ⅰ

圖3 MDV疫苗毒株測序結果Fig.3 Sequence results of MDV vaccine virus

2.2 MDV PCR檢測特異性試驗結果（見圖4）

由圖4可知，MDV-Ⅰ型毒株基因組擴增得到286 bp條帶，CVI988、814疫苗毒株擴增得到463 bp條帶，其他均未擴增出條帶。結果表明，研究建立的PCR方法能夠特異性擴增MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株，并對二者進行區分。

圖4 MDV PCR檢測特異性試驗結果Fig.4 Specificity test of PCR for MDV

2.3 PCR敏感性試驗結果（見圖5、圖6）

由圖5、圖6可知，以MDV-Ⅰ型毒株基因組PCR擴增為模板的檢測下限為0.010 g/mL，以814疫苗毒株基因組PCR擴增為模板的檢測下限為0.010 g/mL，表明本研究建立的PCR方法存在較高敏感性，適用于MDV檢測。

圖5 MDV-ⅠPCR檢測敏感性試驗結果Fig.5 Sensitivity test of PCR for MDV-Ⅰ

圖6 814 PCR檢測敏感性試驗結果Fig.6 Sensitivity test of PCR for 814

2.4 PCR重復性試驗結果（見圖7）

由圖7可知，3次試驗結果一致且均擴增出與預期相符的條帶，表明研究建立的PCR方法具有良好的重復性。

圖7 MDV PCR檢測重復性試驗結果Fig.7 Repetitive test result of PCR for MDV

2.5 對1例免疫失敗雞的檢測（見圖8～圖10）

圖8 MDV免疫失敗試驗結果Fig.8 MDV immune failure test result

圖10 免疫失敗雞MDV疫苗毒株測序結果Fig.10 Sequencing result of MDV vaccine virus in immune-failed chickens

由圖8可知，可擴增得到286、463 bp條帶，分別與野毒株、疫苗毒株大小符合。

由圖9、圖10可知，擴增序列與MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株的序列匹配，確診該疑似MD病死雞為免疫失敗。

圖9 免疫失敗雞MDV-Ⅰ測序結果Fig.9 Sequencing result of MDV-Ⅰin immune-failed chickens

3 討論

本研究經MDV全基因組序列分析發現，CVI988、814疫苗毒株的meq基因相較于MDV-Ⅰ型毒株插入了177 bp的堿基。本研究基于meq基因177 bp插入處，設計引物，運用該引物以MDV-Ⅰ型毒株為模板可擴增得到286 bp的片段，以CVI988、814疫苗毒株為模板可擴增得到463 bp的片段，診斷MDV-Ⅰ型并鑒別其與疫苗毒株；通過特異性試驗、敏感性試驗以及重復性試驗評估，表明該方法特異性強、敏感性高、重復性穩定。應用該方法檢測1例接種過疫苗但感染疑似MDV-Ⅰ型毒株病死雞組織，可同時擴增得到約463和286 bp的片段；2個片段測序結果與預期序列相符，確診該病死雞為免疫失敗造成的死亡。本試驗建立的MDV PCR診斷方法應用于臨床實踐中可及時對雞群進行MD防控，保障養禽業的健康發展。

MDV不斷變異，其毒力也不斷增強。為研制預防MDV超強毒株的疫苗，Su等[15]研究中構建了meq基因缺失株GX0101Δmeq，并篩選獲得了具有良好復制能力且在一定程度上能夠有效控制超強MDV的SC9-1候選疫苗株，但仍需大量的臨床數據驗證該疫苗候選株的安全性。劉長軍等[16]分別通過兩次同源重組構建了meq基因缺失中間體病毒毒株與meq基因缺失疫苗株rMS△meq，在該研究中構建的重組病毒同樣具有良好的免疫保護效力。目前市場上廣泛采用的CVI988和814疫苗毒株在最近幾年頻繁出現免疫失敗的情況[17]。因此，能夠及時、準確地診斷MD并對MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株進行區分至關重要。本研究建立的PCR檢測方法能夠區分MDV-Ⅰ型毒株和現有的CVI988和814疫苗毒株及SC9-1疫苗株和meq基因缺失疫苗株rMS△meq。

MD疫苗免疫失敗還可能存在的原因是雛雞早期感染CIAV、禽網織內皮組織增生癥病毒（REV）等免疫抑制病破壞雞群的免疫功能。MD感染雞群常常和ALV、CIAV、REV等共同感染[18-19]，CIAV和REV均可抑制馬立克氏病疫苗的免疫應答，使MDV在感染雞體內不斷增殖[20-21]，導致MD的嚴重性和影響性進一步擴大。本試驗建立的檢測方法能夠特異性擴增MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株，對CIAV、ALV、IBV、IBDV、IBHV、IAV、NDV均無擴增，展現出較高的特異性。本試驗建立的MDV診斷方法特異性好、敏感性高、重復性穩定，適用于臨床應用。

4 結論

本試驗建立的MDV-Ⅰ的PCR診斷方法可快速有效地診斷MD，區分MDV-Ⅰ和疫苗毒株，篩選免疫失敗的雞群，為快速診斷和區分MD提供了參考。