堿性蛋白酶水解羊血清蛋白的工藝研究

李昕宇，馬金璞，2，張玉璇，2，郭星晨，2，楊具田，2，徐紅偉，2，曹忻，2，高丹丹，2*

（1．西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124；2．西北民族大學生物醫學研究中心，甘肅蘭州 730030）

我國每年羊宰殺量高達170萬頭，羊血產量達510 t。多數屠宰企業的羊血作為屠宰廢棄物直接排放，不僅造成資源浪費，還會污染環境。羊血固體成分中，蛋白質含量約18%[1]，主要由血清蛋白和球蛋白組成[2]，其中血清蛋白占總蛋白的比例較大。血清蛋白含有人體必需的8種氨基酸，進入人體后被消化酶分解成穩定的多肽。羊血多肽具有降血壓、抗氧化、抗菌和增強免疫力等功能[3]，在食品、保健品、藥品和化妝品方面具有廣闊的應用前景。

利用動物血液研發功能性成分已成為研究熱點。如高丹丹等[4]采用中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白得到抗氧化肽；湯海霞[5]采用蛋白酶水解綿羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽；胡鳳姣[6]采用木瓜蛋白酶水解雞血分離出抗菌肽。采用酶解法水解動物血液制備生物活性肽成為最常用的方法，具有價格低廉、易轉化等優點。羊血營養價值豐富，但目前對水解羊血清蛋白的研究相對較少，特別是利用堿性蛋白酶法水解羊血清蛋白制備生物活性肽的研究鮮見報道。本研究采用堿性蛋白酶水解羊血清蛋白，通過測定酶解溫度、水解時間、水解pH值和加酶量對羊血清蛋白水解度的影響，在單因素的基礎上用響應面分析試驗法優化酶解工藝，研究結果為羊血資源和羊血清副產品的開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

新鮮羊血采集自甘肅省甘南自治州夏河縣（地理坐標為：35°12'N，東經102°31'E）。

1.2 試驗試劑

堿性蛋白酶（酶活力100 000 U/g，中生瑞泰科技有限公司）、福林酚（上海中泰化學試劑有限公司）；碳酸鈉溶、三氯乙酸；正丁醇、正丙醇、乙二醇、乙醇等均為分析純。

1.3 試驗儀器

721型紫外分光光度計（惠普有限公司）、TGL-16M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、JA2003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）、PB-10型精密pH計（Sartorius公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 羊血清蛋白酶解液的制備

新鮮羊血加1.5% C6H5O7Na3抗凝，4 000 r/min離心20 min取上清液[7]，脫鹽、超濾濃縮，得到羊血清蛋白。調節pH值，加入堿性蛋白酶，100℃水浴加熱15 min，冷卻至25℃。加2 mL 0.4 mol/L三 氯 乙 酸，8 000 r/min離心15 min取上清液，冷凍干燥，獲得羊血清蛋白酶解粉。

1.4.2 羊血清蛋白水解度（DH）的測定

DH的測定采用茚三酮比色法[8]，本試驗以甘氨酸為標品做標準曲線，以甘氨酸含量（mg）為x軸，吸光值為y軸繪制標準曲線，曲線的回歸方程為y=5.976 8x-0.2149（R2=0.994 5）。配制100 mg/L的羊血清蛋白酶解液，吸取2.0 mL于25 mL比色管中，加入1 mL的1.2%的茚三酮顯色劑和0.1 mL 1%的抗壞血酸溶液，沸水中加熱15 min取出，冷卻至室溫后，加蒸餾水定容到刻度線，采用721型可見分光光度計在570 nm處測OD值，計算DH。

式中：A2為不同時間內酶解液中的總游離-NH2數；A1為羊血清蛋白水解后的總游離-NH2數；A0為羊血清蛋白中自身固有的游離-NH2數。

1.4.3 酶解條件的單因素試驗設計

配制100 mg/L的羊血清蛋白酶解液于25 mL比色管中，固定羊血清蛋白底物濃度為5%，改變酶解溫度（35、40、45、50、55、60、65℃）、反應時間（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 h）、pH值（8、9、10、11、12、13、14）和加酶量（1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g）4個因素條件，考察各因素對羊血清蛋白的水解效果的影響，每個因素做3次平行試驗，取平均值。

1.4.4 試驗設計與響應面分析

根據單因素試驗結果，以酶解溫度（A）、水解時間（B）、pH值（C）和加酶量（D）等4個因素為自變量，以羊血清蛋白的DH（Y）為響應值，設計4因素3水平響應面試驗[9-10]。試驗因素與水平設計見表1。

表1 試驗因素與水平設計Tab.1 Experimental factors and horizontal design

1.5 數據統計與分析

試驗數據采用Origin 8.5軟件進行單因素試驗作圖，SPSS 25軟件進行因素間顯著性分析，Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面法方差試驗分析[11]。P＜0.05表示影響顯著，P＜0.01表示影響極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 酶解溫度對DH的影響（見圖1）

由圖1可知，在試驗測定的溫度范圍內，DH隨著酶解溫度增加呈先增大后降低的趨勢，酶解溫度為50℃時，羊血清蛋白質DH達最高；35～50℃時，DH隨著酶解溫度升高而逐漸升高；50～65℃時，DH逐漸降低。

圖1 酶解溫度對DH的影響Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on DH

結果表明，溫度過高或過低均可影響酶的活性，進而影響羊血清蛋白DH。因此，選取50℃為最佳酶解溫度。

2.1.2 水解時間對DH的影響（見圖2）

圖2 水解時間對DH的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on DH

由圖2可知，在測定范圍內，羊血清蛋白的DH隨著水解時間的增大逐漸升高，水解時間到5 h后，DH上升速率減慢趨于平緩。

其原因是底物羊血清蛋白隨著水解時間不斷減少，而酶解產物的逐步積累也會對堿性蛋白酶和底物之間形成隔斷[12]，從而產生一定的抑制作用。因此，選擇堿性蛋白酶水解羊血清蛋白的最適時間是5 h。

2.1.3 pH值對DH的影響（見圖3）

從圖3可知，在試驗測定范圍內，pH值為8～11時，DH逐漸升高，pH值為11～12時，DH緩慢下降，之后pH值越大，DH下降越快；pH值為11時，羊血清蛋白的DH最高。

圖3 pH值對DH的影響Fig.3 Effect of pH on DH

pH值通過影響堿性蛋白酶分子活性部位上相關基團解離程度[13]，進而影響酶的作用，在最適pH時，酶分子上活性基團的解離狀態與底物結合最佳，pH值高于或低于最適pH時，酶活性基團解離程度降低，影響酶和底物的結合能力及酶的反應速率。因此，確定堿性蛋白酶水解羊血清蛋白的最適pH值為11。

2.1.4 酶添加量對DH的影響（見圖4）

圖4 加酶量對DH的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on DH

從圖4可知，加酶量為1 000～2 500 U/g底物時，DH隨著加酶量的增加而明顯增大。當加酶量3 000 U/g時，DH上升速度已非常緩慢，繼續添加酶，DH變化程度小。

實際生產中，考慮經濟成本[14]應該盡量減少加酶量，故確定堿性蛋白酶水解羊血清蛋白的最適加酶量為3 000 U/g底物。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗（見表2、表3）

通過單因素試驗結果，探究各因素相互作用時對羊血清蛋白DH的影響，固定底物濃度為5%，以羊血清蛋白的DH為響應值，采用響應曲面分析法[15]對堿性蛋白酶水解羊血清蛋白工藝進行4因素3水平優化試驗設計[16]，試驗方案及結果見表2。

表2 Design-Expert試驗設計方案及結果Tab.2 Design-Expert experimental design and results

對表2的數據進行多元回歸分析，以酶解溫度、pH值、水解時間和加酶量為因素進行擬合回歸分析，獲得二次回歸方程。

DH=-403.64+5.41A+34.44C+26.74B+0.04D+0.11AC-0.06AB-2.19AD+0.21CB-1.34CD-4.17BD-0.05A2-3.73C2-1.06B2-2.99D2，方差分析結果見表3。

表3 響應曲面方差分析Tab.3 Response surface analysis of variance

本試驗過程中設計的模型總體表現極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05）[10]，R2與R2Adj差值小，說明響應面的優化程度好[17]；并且R2值較大，說明試驗具有較好重復性。變異系數為0.71%，說明該模型擬合程度較好，試驗誤差小，采用該模型對堿性蛋白酶水解羊血清蛋白的水解過程進行優化合適。由F值得出，影響羊血清蛋白的DH的主次順序為D＞A＞C＞B。

2.2.2 響應面分析與優化（見圖5～圖10）

由圖5～圖10可知，各響應面隨著各個因素增大，羊血清蛋白的DH均呈現先升后降的趨勢，羊血清蛋白的DH存在最大值；通過分析各因素之間相互作用對DH的影響，確定堿性蛋白酶水解羊血清蛋白的最佳范圍。

圖5 酶解溫度和水解時間對DH的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and hydrolysis time on DH

圖10 pH值和加酶量對DH的影響Fig.11 Effect of pH value and amount of enzyme added on DH

AB交互作用時，酶解溫度曲面陡峭幅度變化程度高于pH值且呈橢圓狀密集，表明酶解溫度比pH值的影響更顯著；AC交互作用時，酶解溫度曲面陡峭呈橢圓形，且幅度變化程度高于水解時間，表明酶解溫度比水解時間的影響更顯著；AD交互作用時，堿性蛋白酶添加量曲面呈橢圓狀，且陡峭幅度顯著高于酶解溫度，表明加酶量比酶解溫度的影響更為顯著；BD交互作用時，加酶量曲面陡峭密集，且幅度變化程度高于pH值，表明加酶量比pH值的影響更顯著；BC交互作用時，pH值曲面陡峭幅度變化程度高于水解時間，雖呈圓狀但較為密集，表明pH值比水解時間的影響更顯著。因此，4個因素對羊血清蛋白的DH的影響關系為D＞A＞C＞B，與表3中交互項F值分析結果一致。

圖6 酶解溫度和pH值對DH的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and pH value on DH

圖7 酶解溫度和加酶量對DH的影響Fig.7 Effect of enzymolysis temperature and enzyme amount on DH

2.3 模型驗證試驗

由響應面分析試驗結果和多項回歸方程，得出羊血清蛋白的DH最高時各因素條件分別為溫度51.2℃、水解pH值11.59、水解時間5.10 h、酶添加量為3 155 U/g。在此條件下，羊血清蛋白的DH預測值為26.92%。在最優的水解條件下做3組平行試驗，羊血清蛋白DH分別為27.05%、26.90%和26.97%，其平均值為26.97%，預測結果與實際結果的相對誤差僅有0.19%。因此，得出的試驗模型能準確地預測羊血清蛋白的DH值。但考慮到實際操作情況，對羊血清蛋白質堿性蛋白酶水解條件修正為反應溫度51℃、pH值11.6，反應時間5.1 h和酶添加量3 200 U/g，羊血清蛋白的DH預測值為26.89%。

圖8 水解時間和pH值對DH的影響Fig.8 Effect of hydrolysis time and pH value on DH

圖9 水解時間和加酶量對DH的影響Fig.9 Effect of hydrolysis time and amount of enzyme on DH

3 結論

本研究由單因素結果可知，在酶解溫度50℃、水解時間5 h、pH值11和堿性蛋白酶加量3 000 U/g時，羊血清蛋白的DH值達到最大。在此試驗基礎上使用響應面試驗法，以羊血清蛋白的DH值為響應值，確定堿性蛋白酶水解羊血清蛋白最優條件為：水解時間5.1 h、反應溫度51℃、pH值11.6和加酶量3 200 U/g；在此條件下，羊血清蛋白的DH可達26.89%。由方差分析結果可知，pH值和水解時間、pH值和加酶量、水解時間和加酶量的兩兩交互作用對羊血清蛋白DH影響較顯著；酶解溫度和水解時間、酶解溫度和pH值的兩兩交互作用對羊血清蛋白DH影響不顯著。