基礎成熟液和卵巢保存溫度對牛體外胚胎發育的影響

黃承俊，趙剛，李寧，杜學海，張文軍

（遼寧省農業發展服務中心，遼寧沈陽 110032）

卵母細胞的體外成熟是體外受精和體外胚胎發育的基礎，與之后的受精率和囊胚發育率直接相關，是體外胚胎生產中最為關鍵的一步。為進一步提高牛卵母細胞的體外成熟技術，已有學者從激素[1]、微量元素[2]、生長因子[3]、培養模式[4]等方面進行了大量研究，但在基礎液的選擇與使用上仍較為單一[1-4]。試劑A是一種同時可應用于卵母細胞體外成熟和細胞培養的基礎液，尚未見相關報道。卵母細胞在體外成熟時是卵丘-卵母細胞共培養狀態，有研究表明，卵母細胞的成熟質量與卵丘細胞發育的良好程度具有一定關聯[5-6]。因此，利用試劑A進行牛卵母細胞的體外成熟，或許能夠同時促進卵丘細胞和卵母細胞的發育，進而獲得一定的體外胚胎發育效果。

此外，因從屠宰場獲取限定條件下的試驗材料難度較大，為方便試驗或生產，也有研究探索了不同卵巢保存溫度在牛體外胚胎發育方面的影響[7-10]，結論雖不完全一致，但均表明一定范圍內，不同卵巢保存溫度會對牛體外胚胎生產造成一定影響。因此，在僅進行體外胚胎生產且不做其他因素考慮時，可對卵巢采用非限定溫度的保存方式。關于牛卵巢的常溫保存少有報道，但已有研究表明豬卵巢的常溫保存仍具良好的試驗效果[11-12]。研究對試劑A和卵巢常溫保存體外培養進行了相關試驗，以期為相關研究及生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用卵巢采集自沈陽市沈北新區某個體屠宰場。

試劑除試劑A、試劑B、M199（賽默飛世爾科技）、IVF-100受精液（Research Institute for the Functional Peptides）、胎牛血清（FBS，南京森貝伽生物有限公司）以及卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH，寧波三生制藥）外，均購自Sigma公司。

HERAcell?150 i CO2培養箱、單人超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；水浴鍋（常州邁科諾儀器有限公司）、恒溫加熱臺（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、電子天平（賽多利斯公司）、5702離心機（eppendorf公司）。

1.2 卵母細胞的采集

無菌手術剪刀去除卵巢周圍多余組織，含雙抗的37℃生理鹽水清洗5～6遍。取單個卵巢，吸取表面多余水分，以帶9號針頭的10 mL無菌注射器抽取表面直徑為2～8 mm卵泡的卵泡液于直徑120 mm的細菌培養皿。采卵液為M199+5% FBS+30 mg/L肝素鈉+4.766 g/L Hepes緩沖劑。每抽取5～6個卵巢撿卵一次，挑選具有3層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體（COCs）用于體外成熟。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

1.3.1 .1不同試劑對牛體外胚胎發育的影響

分別選用試劑A和試劑B作為基礎成熟液進行牛卵母細胞的體外成熟。添加成分均為10%FBS、0.01 IU/mL FSH、0.02 IU/mL LH和1 mg/L雌二醇（E2）。卵巢保存條件均為37℃加雙抗生理鹽水的保溫杯。

1.3.1 .2卵巢常溫保存對牛體外胚胎發育的影響

分別采用常溫（空氣溫度測定值為23℃）及37℃加雙抗生理鹽水的保溫杯進行卵巢保存。運輸時間均為1 h以內，卵母細胞體外成熟所使用的液體均為試劑B。

1.3.2 體外成熟

每撿完一次卵，將挑選的COCs于成熟液中洗3遍，之后每40個左右移入平衡至少2 h的成熟液中進行卵母細胞的體外成熟。成熟方法為四孔板法，成熟條件為38.5℃、5%CO2的飽和濕度，培養時間為22～24 h。

1.3.3 精子的洗滌

細管凍精在37℃水浴鍋中解凍后，置于含6 mL受精液的離心管中，2 000 r/min離心7 min，棄去上清液后重復洗滌1次。洗滌好的精子采用受精液稀釋至密度為1×106～6×106個/mL，于CO2培養箱中培養10 min。

1.3.4 體外受精

卵母細胞體外成熟22～24 h，受精液中洗3遍，10枚/組移入平衡至少2 h的50μL受精微滴中，加入50μL的洗滌后備用精子，于CO2培養箱中進行體外受精。受精條件為38.5℃、5%CO2的飽和濕度，受精時間為6 h。

1.3.5 體外培養

體外受精5～6 h，將假定的受精卵于胚胎培養液CR1aa[13]中洗3遍，1 mL移液槍去除周圍部分卵丘細胞及精子，受精卵10枚/組移入平衡至少2 h的含100μL培養液的微滴中進行體外培養。培養條件為38.5℃、5%CO2的飽和濕度。從體外受精開始算起，第48 h觀察卵裂率，第7～8 d統計囊胚發育率，中途不換液。每組試驗重復3次。

1.4 數據統計與分析

試驗數據用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析，LSD、Duncan's法進行雙側檢驗，非齊性采用Dunnett's C進行檢驗。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同試劑對牛體外胚胎發育的影響（見表1）

由表1可知，試劑A的卵裂率與試劑B相比差異不顯著（P＞0.05），但囊胚率顯著低于試劑B（P＜0.05）。

表1 不同試劑對牛體外胚胎發育的影響Tab.1 Effect of different reagent on bovine embryo production in vitro

2.2 不同卵巢保存溫度對牛體外胚胎發育的影響（見表2）

由表2可知，常溫（23℃）保存條件下的卵裂率與37℃條件保存下的卵裂率差異不顯著（P＞0.05），但囊胚率顯著低于37℃保存條件（P＜0.05）。

表2 不同卵巢保存溫度對牛體外胚胎發育的影響Tab.2 Effect of different ovarian storage temperatures on bovine embryonic development in vitro

3 討論

3.1 不同試劑對牛體外胚胎發育的影響

本試驗結果顯示，試劑A獲得了19.04%的囊胚率，表明試劑A也可應用于牛體外胚胎生產體系的建設。試劑A是一種主要應用于細胞分離及培養的基礎液，但也具有應用于卵母細胞體外成熟基礎試劑的效果。本試驗中試劑A的卵裂率與試劑B差異不顯著，但囊胚發育率卻顯著降低，可能由于試劑A與常用的牛卵母細胞體外基礎成熟液相比，添加的是氨基酸成分，缺少了部分利于卵母細胞體外成熟的因子，進而影響卵母細胞體外成熟的質量以及胚胎的后續發育。牛卵母細胞體外成熟的質量與后續受精卵的發育具有直接的關聯性，與本研究結論一致[5-6]。

此外，試劑A是一種可用于細胞培養和卵母細胞體外成熟的液體，而卵母細胞的體外成熟通常是卵丘-卵母細胞復合體的形式。顆粒細胞單層有助于牛卵母細胞的體外成熟，而培養的細胞具備上述功能主要通過卵丘-卵母細胞連接通道進行[6]。本試驗中試劑A有助于卵丘細胞的發育，原因可能是該功能進一步促進了卵母細胞的體外成熟。但試劑A的囊胚率及胚胎的后續發育均不如試劑B，間接表明了細胞共培養有助于卵母細胞體外成熟質量的提升，但并非關鍵因素。綜上所述，試劑A也可應用于牛體外胚胎生產體系的建立，但效果有待進一步提高。

3.2 常溫保存對牛體外胚胎生產體系的影響

牛卵巢的保存溫度與運輸時間有關，一般運輸時間在4 h內時，保存溫度為37℃，運輸時間越長，相對的保存時間越低。為研究常溫保存下的胚胎生產效果，試驗選擇37℃保存條件做對照，結果顯示，常溫保存獲得了21.75%的囊胚率，表明牛卵巢常溫保存可實現體外胚胎生產。但與37℃保存條件相比，常溫保存的囊胚率顯著降低，表明卵巢的保存溫度可顯著影響體外胚胎的后續發育。因常溫保存存在溫度不確定性，故僅建議常溫保存應用于一定條件下的體外胚胎生產，不建議應用于其他因素的分析。

本試驗顯示，卵巢的常溫保存與37℃保存的卵裂率差異不顯著，表明溫度對體外胚胎生產的表面影響主要在卵裂后期，與前人結論一致[7-8]。卵巢是卵母細胞的載體，溫度對卵巢的影響即為對卵母細胞的影響。但無論卵巢保存在4、10℃[9-10]，還是20～25、30～38℃[7-9]，其成熟率和卵裂率均不低，且可獲得一定的囊胚率，表明卵巢保存溫度并非牛體外胚胎生產的決定性因素。目前研究的溫度范圍內，卵母細胞均具有一定的承受能力，故在只考慮生產牛體外胚胎不做其他因素考慮的情況下，可采用常溫保存的便捷方式獲取試驗材料。

4 結論

試劑A可應用于牛體外胚胎的生產，但囊胚率低于試劑B。牛卵巢采集可在常溫下進行，但溫度對受精卵的后續發育影響較大，進行對比試驗時需考慮該因素的影響。