牦牛HMOX1基因克隆及生物信息學(xué)分析

張雅欣，張雅潔，李睿思，唐甜，吳貝寧，麻俊淵，楊妍梅

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030）

牦牛是生活在青藏高原地區(qū)的珍稀物種，在長期進化 過程中表現(xiàn)出了極強的生態(tài)適應(yīng)性，逐漸適應(yīng)了高原低氧環(huán)境[1]。有大量關(guān)于高原動物低氧適應(yīng)性的研究，目前已發(fā)現(xiàn)的有關(guān)低氧適應(yīng)性的基因有缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、促紅細胞生成素基因（EPO）和過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）[2-4]等。張全偉[5]根據(jù)基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)，HMOX1基因也可作為牦牛高原低氧適應(yīng)性的候選基因之一。

HMOX1屬于血紅素加氧酶家族，又稱為熱休克蛋白32，廣泛存在于動物體內(nèi)。HMOX1基因在斑馬魚各組織中均有表達，其中肝臟表達量最高，其次是脾臟、鰓和腎等[6]；HMOX1基因在藏綿羊脾臟中高表達，其次是肝臟和腎臟等[7]；HMOX1基因在牦牛機體則是肺臟中表達量最高[5]。目前，關(guān)于HMOX1基因的低氧適應(yīng)性在藏綿羊[7]、大鼠[8]、合作豬[9]和斑馬魚[10]等動物中均有研究，但該基因在牦牛低氧適應(yīng)分子機制上的研究相關(guān)性報道較少。本研究以牦牛的HMOX1基因為研究對象，利用PCR技術(shù)獲得CDS區(qū)序列，并進行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，為牦牛HMOX1基因在低氧適應(yīng)分子機制中的進一步研究以及牦牛的保護利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

牦牛經(jīng)天祝藏族自治縣某屠宰場處死后，采集肺臟組織，立即放入RNA保護液，4℃保存運輸，4 h內(nèi)帶回實驗室，-80℃保存。

1.1.2 試驗試劑

Trizol試劑（武漢塞維爾生物科技有限公司）；PrimeScript?RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR? Max DNA PolymerasePCR試劑盒、2000 bp DNAmarker和PMD18-T載體（TAKARA公司）。

氨芐青霉素、離心柱型通用型DNA純化回收試劑盒、離心柱型BL21感受態(tài)細胞和質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織總RNA提取、cDNA合成

利用Trizol法提取牦牛肺臟組織總RNA，分光光度儀檢 測 總RNA的 濃 度，選 擇D260/D280值 在1.9～2.0范圍，-80℃保存。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計及合成

根據(jù)NCBI公布的牦牛HMOX1基因序列（XM_005898270.2）的CDS區(qū)，利用primer 5.0軟件進行引物設(shè)計，預(yù)期擴增片段長度為870 bp。

引物序列為：HMOX1-F：5'GGAATTCATGGAGCGCCCGCAGCCCGAC3'；HMOX1-R：5'CCGCTCGAGTCACATGGCGTAAAGCCCC3'。引物由楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增及克隆

以牦牛肺臟組織cDNA為模板，進行PCR擴增。

反 應(yīng) 體 系：PrimeScript?RT Master Mix 12.5 μL、cDNA 2 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，RNase free ddH2O補足至25 μL。

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，68℃退火15 s，72℃延伸60 s，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的片段進行切膠回收。

回收產(chǎn)物與PMD18-T載體在16℃條件下連接3 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，涂布至含50 mg/L氨芐青霉素的LB固體平板上，過夜培養(yǎng)14 h。挑取單菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行PCR驗證，并將質(zhì)粒送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序。

1.2.4 牦牛HMOX1基因的生物信息學(xué)分析

采用在線軟件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對牦牛HMOX1蛋白的理化性質(zhì)進行分析；在線 軟 件Protscale（https://www.expasy.ch/tools/pr-otscale.html）對牦牛HMOX1蛋白的疏水性進行分析；在線軟件TMHMM（https://www.cbs.dut.dk/service/TMHMM）對牦牛HMOX1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進項預(yù)測。

采用在線軟件SignalIP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/）對牦牛HMOX1蛋白質(zhì)信號肽進行預(yù)測；PSORTⅡPrediction（http://psort.hgc.jp/form.html）對HMOX1蛋白亞細胞定位進行預(yù)測；在線軟件NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對牦牛HMOX1蛋白的磷酸化位點進行預(yù)測。

采用在線軟件ExPASy-SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）對牦牛HMOX1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/)對牦牛HMOX1蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；BLAST對HMOX1氨基酸序列進行同源性分析，并使用MEGA11.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛HMOX1基因的克隆及序列測定分析（見圖1～圖3）

圖1 牦牛HMOX1基因PCR擴增檢測結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification assay of HMOX1 gene in yak

由圖1可知，利用Trizol法提取牦牛肺臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行pcr擴增后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條特異性的條帶，大小在750～1 000 bp之間，與預(yù)期序列長度870 bp相符，初步確定此條帶為牦牛HMOX1基因CDS區(qū)。

由圖2、圖3可知，牦牛HMOX1基因編碼區(qū)長度為867 bp，編碼289個氨基酸。本次克隆得到的牦牛HMOX1基因CDS與NCBI上公布的CDS對比發(fā)現(xiàn)有兩個位點發(fā)生堿基突變，核苷酸同源性為99%。其中第622 bp處TTC突變?yōu)镃TC，導(dǎo)致苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔坏?22 bp處ACA突變?yōu)锳CC，為同義突變。

圖2 牦牛HMOX1基因CDS區(qū)核苷酸序列與克隆結(jié)果比對情況Fig.2 Nucleotide sequence of CDS region of HMOX1 gene of yak compared with cloning results

圖3 牦牛HMOX1基因氨基酸序列與克隆結(jié)果比對情況Fig.3 Comparison of amino acid sequence and cloning results of yak HMOX1 gene

2.2 牦牛HMOX1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 牦牛HMOX1蛋白的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析結(jié)果（見表1）

由表1可知，HMOX1基因CDS區(qū)包含870個核苷酸，編碼289個氨基酸，包括35個負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）和34個正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys），分子量為32 876.64，理論等電點為6.68。牦牛HMOX1蛋白的分子式為C1479H2325N401O431S8，組成的原子總數(shù)為4 644個。在哺乳動物細胞中的半衰期為30 h，在酵母中的半衰期大于20 h，在大腸桿菌中的半衰期大于10 h。預(yù)測該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為55.07，表明該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

表1 HMOX1基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析結(jié)果Tab.1 Result of amino acid composition analysis of proteins encoded by HMOX1 gene

2.2.2 牦牛HMOX1蛋白的疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（見圖4、圖5）

由圖4可知，第276位絲氨酸疏水性最強（+2.544），第67位谷氨酸和第68位精氨酸親水性最強（-2.767），總平均親水性為-0.447，表明HMOX1蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

圖4 牦牛HMOX1蛋白疏水性分析結(jié)果Fig.4 Result of hydrophobicity analysis of yak HMOX1 protein

由圖5可知，牦牛HMOX1蛋白可能存在1個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，其跨膜螺旋區(qū)預(yù)測位置在266～288，并且跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值為19.558 37，表明HMOX1蛋白為跨膜蛋白，可能與信號傳導(dǎo)有關(guān)。

圖5 牦牛HMOX1蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域分析結(jié)果Fig.5 Result of analysis of transmembrane helix structure region of yak HMOX1 protein

2.2.3 牦牛HMOX1蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測結(jié)果（見圖6）

由圖6可知，C值為0.107，Y值為0.106，S值為0.117。信號肽主要位于分泌蛋白的N端，當S值均大于0.5時屬于分泌蛋白，結(jié)果表明，牦牛HMOX1基因蛋白N端不存在信號肽，屬于非分泌蛋白。

圖6 牦牛HMOX1蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.6 Predicted result of HMOX1 protein signal peptide in yak

2.2.4 牦牛HMOX1蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果（見圖7）

由圖7可知，牦牛HMOX1蛋白分布在細胞質(zhì)的可能性為26.10%，在細胞核和分泌系統(tǒng)囊泡的可能性均為17.40%，在線粒體的可能性為13.00%，在漿膜的可能性為8.70%，在細胞骨架、空泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的可能性均為4.30%，表明牦牛HMOX1蛋白可能為胞質(zhì)蛋白。

圖7 牦牛HMOX1蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果Fig.7 Prediction result of subcellular localization of yak HMOX1 protein

2.2.5 牦牛HMOX1蛋白磷酸化位點預(yù)測結(jié)果（見圖8）

由圖8可知，有14個絲氨酸磷酸化位點，分別在第8、9、15、54、143、160、161、175、185、243、254、261、264和276位；有17個蘇氨酸磷酸化位點，分別在第22、27、44、76、109、112、125、136、169、177、189、193、206、223、251、274和281位；有11個酪氨酸磷酸化位點，分別在56、59、75、79、98、108、115、135、138、183和287位。

圖8 牦牛HMOX1蛋白磷酸化位點預(yù)測結(jié)果Fig.8 Prediction results of phosphorylation sites of yak HMOX1 protein

2.2.6 牦牛HMOX1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（見圖9）

由圖9可知，有176個氨基酸參與α-螺旋，占比位60.90%；有12個氨基酸參與β-折疊，占比為4.15%；有91個氨基酸參與無規(guī)則卷曲，占比為31.49%。由此表明，牦牛HMOX1蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要形式為α-螺旋和無規(guī)則卷曲。

圖9 牦牛HMOX1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.9 Prediction results of secondary structure of yak HMOX1 protein

2.2.7 牦牛HMOX1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（見圖10）

由圖10可知，應(yīng)用于建立該三維模型的氨基酸殘基范圍為11～224，以4wd4.1.A蛋白為模板，序列同源性為82.99%，GMQE值為0.76，QMEAN值為1.12，模型準確度可信。

圖10 牦牛HMOX1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.10 Prediction results of tertiary structure of yak HMOX1 protein

2.2.8牦牛HMOX1基因同源性分析及系統(tǒng)進化樹

將克隆得到的牦牛HMOX1核苷酸序列和在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索得到的牦牛（XM_005898270.2）、野牛（XM_010859613.1）、黃牛（NM_001014912.1）、雜交肉牛（XM_027541841.1）、瘤 牛（XM_019961273.1）、水 牛（XM_045165381.1）、綿羊（MK630326.1）、山羊（NM_001285567.1）、豬（NM_001004027.1）、羊 駝（XM_006207028.3）、野駱駝（XM_032492109.1）、單峰駝（XM_032492109.1）、雙 峰 駝（XM_010946133.2）、馬（XM_023631135.1）的核苷酸序列通過BLAST在線軟件進行同源性比對，利用MEGA11.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，見圖11。

由圖11可知，克隆得到的牦牛HMOX1核苷酸序列與牦牛、野牛、黃牛、雜交肉牛、瘤牛、水牛、綿羊、山羊、豬、羊駝、野駱駝、單峰駝、雙峰駝和馬的氨基酸序列同源性分別為99.77%、99.31%、99.19%、99.19%、99.08%、97.81%、96.19%、96.08%、88.51%、88.36%、88.02%、88.02%、87.90%和85.44%，說明牦牛與牛的親緣關(guān)系最近，與羊的親緣關(guān)系較近，與馬的親緣關(guān)系最遠，符合實際情況。

圖11 HMOX1基因系統(tǒng)進化樹Fig.11 Phylogenetic tree of HMOX1 gene

3 討論

HMOX1是血紅素分解代謝過程中的限速酶，廣泛存在于機體組織，能夠?qū)Φ脱酢⒀趸瘧?yīng)激等刺激做出應(yīng)答[11]。血紅素具有強促氧化作用，對細胞器有害。當機體受到破壞性刺激時，游離血紅素含量提高，促進HMOX1的表達并形成負反饋調(diào)節(jié)，血紅素被分解形成膽綠素，進一步被還原為膽紅素[12]。膽紅素具有強抗氧化性，能夠降低氧化應(yīng)激引起的損傷，是心血管疾病等的保護因素[13]。

研究表明，HMOX1基因可導(dǎo)致深靜脈血栓溶解[14]，并通過誘導(dǎo)HMOX1的表達增強抗氧化的能力，減少氧化應(yīng)激對血管的損傷[15]。宋佳倫等[16]通過質(zhì)譜篩選，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)使膠質(zhì)瘤干細胞（GSC）HMOX1基因高表達，可顯著抑制GSC的活力。杜嘉祥等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HMOX1表達下降會引起胞紅蛋白（CYGB）表達下降，進而降低牦牛低氧適應(yīng)能力。上述研究均表明，HMOX1基因?qū)游镅趸瘧?yīng)激以及低氧適應(yīng)具有調(diào)控作用。

本試驗通過克隆牦牛HMOX1基因CDS區(qū)，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)長度為867 bp，共編碼289個氨基酸，該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為54.14，大于40，表明HMOX1蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。HMOX1蛋白為親水性蛋白，存在一個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，且二級結(jié)構(gòu)的主要形式為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，說明該結(jié)構(gòu)是HMOX1蛋白重要的組成構(gòu)件。

張全偉[5]對天祝白牦牛HMOX1蛋白進行結(jié)構(gòu)與功能分析，發(fā)現(xiàn)存在289個氨基酸殘基，不穩(wěn)定系數(shù)為55.07，親水性為-0.447，表明該蛋白為親水性蛋白，存在一個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。何建文[18]對藏綿羊HMOX1蛋白進行結(jié)構(gòu)與功能分析，發(fā)現(xiàn)存在288個氨基酸殘基，不穩(wěn)定系數(shù)為81.04，親水性為-0.489，表明該蛋白為親水性蛋白，存在一個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致。

本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)，有15個絲氨酸磷酸化位點、17個蘇氨酸磷酸化位點和11個酪氨酸磷酸化位點，其中第8位、第161位和第185位絲氨酸磷酸化位點可能性為0.953、0.961和0.962，相對具有較高的可能性。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)功能的重要機制，對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等具有重要作用[19]。

本研究通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，表明牦牛與牛的親緣性最近，與羊的親緣性較近，血紅素加氧酶在進化過程中相對保守。王偉等[9]對合作豬HMOX1基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合作豬與牛的氨基酸同源性為85.5%，符合進化情況。

4 結(jié)論

本試驗成功克隆了HMOX1基因CDS區(qū)序列，對牦牛HMOX1蛋白進行了理化性質(zhì)、親水性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、信號肽、卷曲螺旋、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的分析，并構(gòu)建了牦牛與其他品種牛HMOX1基因的進化關(guān)系。研究為深入分析牦牛HMOX1基因的生物學(xué)功能和對該基因低氧適應(yīng)機制的深入研究及臨床應(yīng)用提供了一定參考。