1株降解牦牛血液菌株的分離鑒定

馬子豪，向軍，紀曉嵐，廖慶艷，張福梅，周雪雁，3*

（1．西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124；2．西北民族大學醫學院，甘肅蘭州 730030；3．西北民族大學生物醫學研究中心，甘肅蘭州 730030）

我國畜禽血液年產量可達1.9×109kg，其中含有蛋白 3.6×108kg。原料血液不易儲藏、易污染、口感差等特點嚴重制約了畜禽血液的利用，傳統的掩埋、焚燒等物理方法無法很好地利用血液資源，還造成了環境污染[1]。國內外普遍采用噴霧干燥、蒸煮干燥等方法將血液加工成血粉，并通過酸堿水解、微生物發酵、酶解等方法將其中的蛋白質分解為可利用的肽和氨基酸[2]。2001年，《禁止在反芻動物飼料中添加和使用動物性飼料的通知》明文規定禁止在反芻動物飼料中使用動物性飼料，動物性飼料的使用量大幅降低，嚴重制約了家畜血液的利用。微生物法降解廢棄血液是目前公認的血液綜合利用的研究方向。微生物法處理后的血液富含氨基酸和短肽，可應用于制備氨基酸肥料，最終實現廢棄血液循環利用的可持續發展道路。

1996年，解硫胺素芽孢桿菌被正式命名，目前共3個種[3]。米氏硫胺素芽孢桿菌屬于芽孢桿菌科解硫胺素芽孢桿菌屬，桿狀，為革蘭氏陽性菌，芽孢呈橢圓形，芽孢亞端生、近中生、中生、包囊稍膨大，能夠在營養瓊脂和酪朊大豆瓊脂等培養基中生長[4]。目前國內外對米氏硫胺素芽孢桿菌的研究主要集中于分離鑒定[5-6]、生物降解[7-8]、生物防治[9-10]及基因序列[11-12]等方面。本文初次研究米氏硫胺素芽孢桿菌降解牦牛血液的能力，為探究微生物法降解血液提供了一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集采集于甘肅省蘭州市一屠宰場深度20～30 m處的土樣，地理坐標為N 36°03′，E 103°40′。

1.1.2 試驗試劑

水解酪蛋白胨（MH）肉湯干粉培養基、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（天津市光復科技發展有限公司）；黃豆餅粉（北京鴻潤寶順科技有限公司）；氯化鈉、無水碳酸鈉（天津市大茂化學試劑廠）；水解酪蛋白胨（MH）瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）、革蘭氏染色試劑（博精索拉博科技有限公司）、福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）、細菌DNA提取試劑盒（TaKaRa-美谷生物科技有限公司）；胰化蛋白胨、酵母提取粉（OXOID公司）；三氯乙酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）、血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）、細菌生化鑒定管（杭州微生物試劑有限公司生產）。

1.1.3 培養基

水解酪蛋白胨（MH）瓊脂培養基：可溶性淀粉1.5 g/L、瓊脂17 g/L、牛肉浸粉2 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L。

LB液體培養基：氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L、胰化蛋白胨10 g/L。

液體發酵培養基：玉米粉4 g/L、黃豆餅粉3 g/L、磷酸氫二鈉4 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L。

LB固體培養基：胰化蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉20 g/L。

1.1.4 試驗儀器

13395H2XBME顯微鏡（上海徠卡顯微系統有限公司）、電泳儀（北京六一儀器設備公司）、AR224CN電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）、YXQ-LS全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫療生物儀器股份有限公司）、微波爐（廣東格蘭仕公司）、SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、恒溫恒濕箱（上海一恒科學儀器有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集采用無菌袋從屠宰場廢棄血液存放地采集土壤樣品，實驗室低溫保存柜中凍存；血液樣品亦采集自屠宰場。

1.2.2 菌株的純化篩選

將土壤樣品進行10-3～10-5梯度稀釋，取200 μL稀釋液涂布于血瓊脂培養基，37℃培養24 h。挑取溶血環較大的單菌落劃線接種于血瓊脂平板上，37℃培養24 h直至純化成功，將有溶血環的菌株按常規方法保存。

1.2.3 形態學鑒定

分離株劃線接種于血瓊脂平板上，37℃培養48 h，觀察菌落顏色、大小、形狀、邊緣、隆起、透明度等指標。挑取少量菌落革蘭氏染色后鏡檢，在光學顯微鏡油鏡下觀察菌體細胞的形狀、大小及染色結果[1]。

1.2.4 生化鑒定

挑取純化單菌落于LB液體培養基，37℃培養24 h。吸取50 μL菌液于硝酸鹽還原、氨基酸水解、枸櫞酸鹽等，按生化鑒定管說明書中條件培養，觀察并記錄試驗結果。

1.2.5 藥敏試驗

挑取純化單菌落于LB液體培養基中，37℃培養24 h。吸取150 μL量菌液于水解酪蛋白胨（MH）瓊脂培養基中涂布均勻。在LB固體培養基上等間距放置阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、四環素、多西環素、環丙沙星等藥片，37℃培養24 h，觀察試驗結果。

1.2.6 16S rRNA基因序列鑒定

挑取目標菌株至LB液體培養基，在37℃180 r/min搖床培養10 h。取1.5 mL培養液，使用細菌DNA提取試劑盒，提取菌株NWMCC0050基因組DNA。采用16S rRNA全長引物合成27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，擴增細菌核糖體16S rRNA。將PCR產物送至北京擎科生物技術有限公司進行16S rRNA基因序列的測序。所得序列上傳至數據庫GenBank，利用BLASTN功能對測序所得16S rRNA基因序列進行同源性的比對，利用MEGA 7.0軟件構建相應的系統進化樹[13]。

1.2.7 蛋白酶活力測定

取1環細菌接入LB液體培養基，37℃培養18 h，以3%接種量接入80 mL發酵培養基，置于250 mL搖瓶，37℃搖床180 r/min發酵30 h，取上清液，采用福林法檢測其中蛋白酶的酶活力[14]。

1.2.8 血液降解效果測定

挑取目標菌株至LB液體培養基，37℃180 r/min搖床培養24 h。另取30 mL牦牛血8 000 r/min離心1 min，加入純水制備成100 mL血液培養基。培養物按2%接種量接入血液培養基，在37℃條件下培養85 h，測定總氮和游離氮。游離氮的測定依據《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》GB 5009.5—2016中甲醛法，總氮的測定依照其中凱氏定氮法，并計算降解效率[2]。

發酵液降解度（DH）=A/N×100% （1）

式中：A為發酵液中氨基酸態氮含量；N為底物中所含總氮含量。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態學鑒定（見圖1、圖2）

由圖1可知，純化后的菌株為需氧菌，于血瓊脂平板培養基上可形成乳白色、不透明、無金屬光澤、突起、邊緣不整齊的大菌落，在血瓊脂平板培養基上培養后可見典型的β型溶血。

圖1 菌株NWMCC0050血瓊脂平板培養結果Fig.1 Result of blood agar plate culture of strain NWMCC0050

由圖2可知，分離株為革蘭陽性桿菌，產芽孢，單個、成對或成列排布。根據對分離培養菌形態學特性初步分析，分離株初步判定為芽孢桿菌，并命名為NWMCC0050。

圖2 菌株NWMCC0050革蘭氏染色結果Fig.2 Gram staining result of strain NWMCC0050

2.2 菌株NWMCC0050生化鑒定結果（見表1）

由表1可知，在生化試驗中菌株NWMCC0050可利用麥芽糖、葡萄糖及還原硝酸鹽，反應結果為陽性。該菌無法利用乳糖、阿拉伯糖、山梨糖、衛矛醇、甘露醇、水楊素、硫化氫、尿素及肌醇等物質，反應結果為陰性。

表1 菌株NWMCC0050生化鑒定結果Tab.1 Biochemical identification results of strain NWMCC0050

2.3 菌株NWMCC0050藥敏試驗結果（見表2）

由表2可知，菌株NWMCC0050對14種抗生素的敏感性各不相同：對阿莫西林（AMC30）、頭孢噻吩（KF30）、頭孢他啶（CAZ30）表現耐藥，對紅霉素（E15）、氯霉素（C30）、頭孢西?。‵OX30）表現中介，對阿米卡星（AK30）、慶大霉素（CN10）、鏈霉素（S10）、四環素（TE30）、多西環素（DO30）、環丙沙星（CIP5）、克林霉素（DA2）、萬古霉素（VA30）等8種藥物表現為敏感。藥敏試驗結果表明，菌株NWMCC0050符合解硫胺素芽孢桿菌的特點。

表2 菌株NWMCC0050藥敏試驗結果Tab.2 Result of drug sensitivity test of strain NWMCC0050

2.4 菌株NWMCC0050的16S rRNA基因序列鑒定（見圖3、圖4）

由圖3可知，菌株NWMCC0050的DNA提取基因序列條帶大約為15 000以上。

圖3 提取細菌組DNA瓊脂糖電泳凝膠結果Fig.3 Result of agarose gel electrophoresis of DNA extracted from bacteria

使用NCBI中BLAST功能將GenBank數據庫中16S rRNA基因序列與菌株NWMCC0050的16S rRNA基因序列進行同源性比較。結果顯示，菌株NWMCC0050與Aneurinibacillus migulanusstrain NBRC 15520的序列相似性為99.85%。在BLAST下載與菌株NWMCC0050基因序列最相似的10組菌株的16S rRNA基因序列，通過軟件MEGA 7.0進行多重比對并構建系統發育樹見圖4。

由圖4可知，菌株NWMCC0050與解硫胺素芽孢桿菌位于同一個分支，遺傳距離較近，鑒定為芽孢桿菌屬的解硫胺素芽孢桿菌。

圖4 菌株NWMCC0050基因序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of NWMCC0050 gene sequence of isolates

2.5 菌株NWMCC0050蛋白酶活力的測定（見圖5）

以吸光度值為橫坐標，酪氨酸濃度值為縱坐標，繪制標準曲線[13]。

由圖5可知，該菌株產蛋白酶活力標準曲線的回歸方程為y=0.010 1x+0.000 4，R2=0.999 4。當光密度為1時，計算得酪氨酸質量K=98.61，蛋白酶活力為139.54 U/mL。

圖5 酶活標準曲線Fig.5 Standard curve of enzyme activity

2.6 血液蛋白降解效果（見圖6）

測得試驗組中氨基態氮含量為281.73 g/100 L，血液中總氮含量為2 856.26 g/100 L。通過公式計算得出菌株NWMCC0050對血液的降解率為9.86%。

由圖6可知，未降解前的血液呈紅色，降解后的血液顏色加深，表明菌株NWMCC0050對血液具有較強的適應性，能夠一定程度上降解血液，可作為降解廢棄血液的備用菌株。

圖6 血液培養基降解前后變化Fig.6 Changes before and after degradation of blood medium

3 討論

利用微生物法降解屠宰場廢棄血液進而制備氨基酸有機肥的關鍵是篩選產蛋白酶酶活力高、血液降解能力強的菌株。李浩麗等[15]在菜市場新鮮豬血中分離得到1株芽孢桿菌，測定其酶活為150.86 U/mL。Yao等[16]從屠宰場取樣分離出1株短小芽孢桿菌，其蛋白酶活力可達35.437 U/mL，當血粉添加量為2.1%時，可降解85%的血紅蛋白。陶艷華等[17]從南京某屠宰場分離到1株短小芽孢桿菌，在培養基中降解率達53.64%。

本研究分離得到的解硫胺素芽孢桿菌的蛋白酶活力低于上述幾種菌株，推測可能是發酵培養基選擇不當、發酵條件有待優化或位于胞內的蛋白酶未能穿過胞外所致。菌株NWMCC0050血液降解效率的提升可通過探究其在血液培養基中的不同生長條件進行逐步優化，之后多種菌株混合培養以及菌酶混合培養也是提升菌株血液降解效率的優良方法。此外，本研究為分離鑒定可降解血液的菌株以及初步探究其血液降解能力提供了一種簡單且可供參考的試驗方法。

氨基酸肥料是一種新型的生態肥料，其使用范圍也將愈發廣泛[18]。溫明霞等[19]研究表明，噴施氨基酸肥料可增加春梢的果皮亮度及可食率。趙勇[20]研究表明，施用氨基酸肥料的黨參可增產2 075 kg/hm2。李廷勛等[21]利用地衣芽孢桿菌和大豆來源的蛋白酶降解家畜血液，制成了1種液態氨基酸肥料，均衡地保留了充足的二重縮氨酸、三重縮氨酸等各種形態的氨基酸，使肥效更加持久；同時采用地衣芽孢桿菌對血液進行前處理，有效減少酶的用量及制備時間，節約了制備的成本，為后續研究提供了一種可行思路。目前，國內外對微生物法降解廢棄血液的研究尚不夠深入，利用此法制備氨基酸液態肥亟須進一步探究。

4 結論

本研究利用血瓊脂平板從甘肅一屠宰場血液浸潤土樣中分離得到菌株NWMCC0302，根據形態學、生化鑒定及16S rDNA測序分析，鑒定為短小芽孢桿菌。當目標菌株以2%的接種量添加到體積分數為30%的牦牛血液培養基中時，經37℃180 r/min搖床培養85 h可測得其對血液培養基的降解效率達9.86%，具有一定的降解血液能力。