海馬小膠質細胞活化介導慢性應激誘導缺血性腦卒中大鼠抑郁樣行為的研究

陶 希，楊 晨，唐文靜，4，伍思源，鄧景貴，3*

1 湖南師范大學附屬第一醫院（湖南省人民醫院），湖南長沙 410016；2 湖南師范大學神經修復學湖南省重點實驗室，湖南長沙 410016；3 湖南省腦血管病康復臨床醫學研究中心，湖南長沙 410016；4 湖南省康復醫院，湖南長沙410003

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是腦卒中后繼發性情感障礙的一種，表現為快感減少、興趣缺乏、情緒低落、無價值感及睡眠障礙等［1］，患病率28.00%～50.24%［2］。PSD不僅影響患者的生活質量，而且增加卒中復發風險，甚至增加致殘率和病死率［3］。

現實中，腦卒中患者常常暴露于不同應激狀態中。如急性期，疾病本身的軀體應激、監護室內聲光刺激、管道刺激及約束帶約束等；恢復期，雖然與生命支持相關的管道刺激減少，周圍環境有所改善，但是患者對自身的軀體狀況、言語功能、吞咽功能、生活壓力及社會地位等相關感知更為清晰，這會帶來軀體和心理的雙重打擊。盡管各項功能恢復可能會進入平臺期，對疾病轉歸的認知會有所改變或接受，但是仍有一部分患者難以回歸家庭和社會。持續的孤立感及長期的心理應激等因素，致使部分患者終身處于抑郁狀態。所以，卒中后各種不利環境和功能障礙可能是一種持續的慢性應激，不僅促進PSD 的發生，還可能嚴重影響其他功能障礙的預后。

然而，PSD的病理、生理學機制尚不明確。除固有的內源性生物學因素外，外源性的環境和軀體應激也是不可忽略的重要因素。研究發現，小膠質細胞活化在介導2 種因素條件下的中樞免疫-炎癥機制中扮演重要角色［4］。當血管神經單元受到缺血、缺氧或炎癥因子刺激時，靜息的小膠質細胞通過突觸感知微環境變化而被激活，然后形成吞噬性阿米巴樣細胞［4-5］。根據應激的不同程度和持續時間，極化狀態的小膠質細胞可分泌促炎性細胞因子（如IL-6、TNF-α 和IL-1β）和/或抗炎性細胞因子（如IL-10、IL-4 和TNF-β），從而介導抑郁癥狀的發生和發展［4］。課題前期研究發現，慢性應激不僅可以激活額葉和紋狀體小膠質細胞表達增加［5］，還可以降低海馬抗炎因子TGF-β1 表達［6］。但是，缺少對海馬小膠質細胞及炎癥反應的動態觀察。本研究彌補既往研究中的不足，以期為PSD 患病機制及潛在干預措施提供支持信息。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康雄性SD 大鼠75 只，體質量250～280 g，由湖南斯萊克景達有限公司提供［許可證號：SYXK（湘）：2020-0017］。大鼠運送至動物中心后，在恒定溫度、濕度及光線條件下適應性飼養1周，期間自由進食和飲水。本研究獲得湖南省人民醫院動物倫理委員會批準（審批號：202102）。

1.2 主要儀器和試劑

SDS-PAGE 電泳系統、顯影儀及Image lab 軟件（Bio-Rad，美國）；熒光顯微鏡（Olympus，日本）；高速低溫離心機（湖南湘儀集團）；栓線（北京西濃）；4%多聚甲醛（武漢賽維爾）；2%TTC 溶液（北京索萊寶）；RIPA（江蘇凱基）；Iba-1 一抗（小鼠抗大鼠，美國Thermo Fisher）；IL-1β 一抗（兔抗大鼠，美國Affinity）；IL-18（兔抗大鼠，美國Affinity）；GAPDH一抗（兔抗大鼠，美國Affinity）；IgG 二抗（羊抗小鼠，中國Biosharp）；IgG 二抗（羊抗兔，中國Biosharp）；DAPI染色液（中國Wellbio）。

2 實驗方法

2.1 動物分組

適應性飼養1 周后，構建大鼠右側大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。造模術后1 周，根據SPSS 隨機數字生成器將大鼠分布至卒中組（n＝45）和“卒中＋應激”組（n＝30）。然后，再根據時間點要求將卒中組大鼠分成卒中1 周組（n＝15）、卒中2 周組（n＝15）及卒中4 周組（n＝15），將“卒中＋應激”組大鼠分成“卒中2 周＋應激1 周”組（簡稱“應激1 周組”，n＝15）和“卒中4周＋應激3周”組（簡稱“應激3周組”，n＝15）。

2.2 動物造模

2.2.1 MCAO造模 參考課題組前期研究并改良［5］，以線栓法構建右側MCAO模型，缺血時間70 min。

2.2.2 慢性不可預見的溫和應激造模 在MCAO造模的基礎上，以慢性不可預見的溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）結合孤養的方法構建PSD 模型。包括：①晝夜顛倒36 h；②禁水18 h；③禁食20 h；④潮濕環境12 h；⑤45°傾斜籠子17 h；⑥水平振蕩5 min；⑦噪音刺激10 min；⑧夾尾巴1 min；⑨4 ℃冷水強迫游泳5 min；⑩空間限制2 h。將前5 個“長時程”之一聯合后5 個“短時程”之一，每天以2種方法隨機刺激卒中大鼠，共3周。MCAO術中/術后、CUMS 過程中大鼠死亡以及無行為學評分變化的大鼠，均視為造模失敗，以同一批次的大鼠補充造模。

2.3 神經功能缺損評分

MCAO 術后12 h 采用Longa 法行神經功能缺損評分［6］。0 分：無缺損；1 分：不能伸展左側前爪；2分：向左側轉圈；3分：向左側傾倒；4分：不能行走，或意識喪失。其中，0分和4分者被剔除。

2.4 觀察指標

2.4.1 體質量測量及行為學評定

2.4.1.1 體質量測量 MCAO 術后1 周、2 周及4 周分別測量體質量。

2.4.1.2 曠場試驗 曠場試驗（open filed test，OFT）是在弱光線且安靜的環境下，將大鼠放入箱內中央，觀察10 min內的活動情況：①水平運動，以橫穿箱子底面的格子數（4爪均入格）計數；②垂直運動，以前爪抬起直立次數計數［1］。

2.4.1.3 新奇抑制攝食測試 新奇抑制攝食測試（novelty-suppressed feeding test，NSFT）［1］是將大鼠禁食16 h，置于一籠內進行測試，3 塊新鮮餅干以白紙墊托并置于籠中間，記錄大鼠進食第一口食物所需時間（潛伏期），記錄10 min 內食物消耗量；若5 min內未進食則視潛伏期為5 min。

2.4.1.4 蔗糖偏愛測試 蔗糖偏愛測試（sucrose preference test，SPT）在第1 天予2 瓶1%蔗糖水，第2 天予蔗糖水和純水各1 瓶；評定前禁食禁水12 h，評定時蔗糖水和純水各1瓶，記錄12 h各自消耗量。通過公式計算出蔗糖偏愛指數（sugar preference index，SPI）。

蔗糖偏愛指數＝［（糖水消耗量/（糖水消耗量＋純水消耗量）］×100%在卒中后1 周、2 周及4 周，按OFT、NSFT、SPT順序評分。遇爭議問題需2人協商解決［1］。

2.4.2 TTC 染色檢測殘存腦體積 于各時間點，每組取大鼠（n＝5）以10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉。取新鮮腦于-20 ℃冷凍5 min，從額極等距離分割5 等份，再以2%TTC 染色液室溫封閉20 min。等距手機拍照，采用Image J 軟件分析圖片，以健側大腦為對照，計算大鼠患側腦萎縮面積，再結合腦片厚度及層數計算腦萎縮或梗死體積。

患側殘存腦體積比＝（健側大腦半球體積－患側腦萎縮體積）/健側大腦半球體積×100%

2.4.3 Western blot檢測Iba-1、IL-1β及IL-18 分別于MCAO術后1周、2周及4周時，各組取大鼠（n＝5）以10%水合氯醛腹腔麻醉處死。取-80 ℃保存的海馬組織以RIPA 裂解液充分裂解，冰上超聲處理，于4 ℃以12 000 r/min 離心15 min，收集上清液。以A280 紫外光吸收法測蛋白濃度。SDS-PAGE 分離蛋白，再轉膜及封閉。將膜與Iba-1單抗（1∶3 000）、IL-1β 多抗（1∶1 000）或者IL-18 多抗（1∶1 000）結合，4 ℃孵育過夜；再與二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。GAPDH（1∶10 000）作為內參。以Image lab 軟件分析條帶灰度值。

2.4.4 制作石蠟切片及免疫熒光染色檢測Iba-1 分別于MCAO術后1周、2周及4周時，各組取大鼠（n＝5）以10%水合氯醛腹腔麻醉，再以4 %多聚甲醛心臟灌注。取鼠腦于4%多聚甲醛在4 ℃冰箱固定過夜。石蠟包埋，5 μm 厚度連續切片。二甲苯及梯度乙醇脫蠟后行熱修復抗原，于10%山羊血清封閉。于4 ℃與Iba-1一抗（1∶50）孵育過夜，再以綠色熒光標記的二抗（1∶100）于37 ℃孵育。DAPI 工作液染核。甘油封片。計算CA1區視野熒光強度值。

2.5 統計學方法

采用SPSS 24.0 軟件進行統計分析。所有計量資料采用（）表示，2 組間的數據比較采用獨立樣本t檢驗；不同時間點（指代3組間）數據的比較采用單因素方差分析（事后比較采用Tukey）。以P＜0.05認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 5組大鼠體質量與行為學評分比較

3.1.1 5 組大鼠體質量比較 MCAO 術后2 周時，與卒中2 周組比較，應激1 周組大鼠體質量下降（P＜0.05）。MCAO 術后4 周時，與卒中4 周組比較，應激3周組大鼠體質量下降更為明顯（P＜0.05）。見表1。

3.1.2 5 組大鼠OFT 比較 MCAO 術后2 周時，與卒中2 周組比較，應激1 周組大鼠直立運動次數和穿格子數減少（P＜0.05）。MCAO 術后4 周時，與卒中4周組比較，應激3周組大鼠直立運動次數和穿格子數減少更為明顯（P＜0.05）。見表1。

3.1.3 5 組大鼠NSFT 比較 MCAO 術后2 周時，與卒中2 周組比較，應激1 周組大鼠NSFT 潛伏期和攝食量變化不明顯（P＞0.05）。MCAO 術后4 周時，與卒中4 周組比較，應激3 周組大鼠NSFT 潛伏期明顯延長（P＜0.05），攝食量明顯減少（P＜0.05）。見表1。

3.1.4 5 組大鼠SPI 比較 MCAO 術后2 周時，與卒中2周組比較，應激1周組大鼠SPI下降不明顯（P＞0.05）。MCAO 術后4 周時，與卒中4 周組比較，應激3周組大鼠SPI明顯下降（P＜0.05）。見表1。

表1 5組大鼠體質量與行為學評分比較（，n＝15）Table 1 Comparison of body weight and behavioral scores of rats in five groups（，n=15）

表1 5組大鼠體質量與行為學評分比較（，n＝15）Table 1 Comparison of body weight and behavioral scores of rats in five groups（，n=15）

注：與卒中2周組比較，1）P＜0.05；與卒中4周組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the 2-week stroke group,1)P＜0.05;compared with the 4-week stroke group,2)P＜0.05.

3.2 5組大鼠殘存腦體積比較

肉眼可見圖中5組患側胼胝體及紋狀體不同程度萎縮，以應激組為甚。MCAO 術后2 周時，與卒中2 周組比較，應激1 周組殘存腦體積比變化不明顯（P＞0.05）。MCAO 術后4 周時，與卒中4 周組比較，雖然應激3 周組殘存腦體積比有所減少，但是差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 5組腦切片TTC染色（A）及殘存腦體積比（B）比較Figure 1 Comparison of TTC staining（A）and ratio of residual brain volume（B）in brain sections of five groups

3.3 5組大鼠患側海馬Iba-1、IL-1β 及IL-18表達比較

MCAO術后2周時，與卒中2周組比較，應激1周組大鼠患側海馬Iba-1、IL-1β 及IL-18 表達增加不明顯（P均＞0.05）。MCAO 術后4 周時，與卒中4 周組比較，應激3 周組大鼠患側海馬Iba-1、IL-1β 及IL-18表達均顯著增加（P均＜0.05）。見圖2。

縱向比較：與應激1 周組比較，應激3 周組大鼠患側海馬Iba-1、IL-1β 及IL-18 表達均顯著增加（P均＜0.05）。卒中組3 個不同時間點的患側海馬Iba-1、IL-1β 及IL-18 表達差異有統計學意義（P＜0.05）；兩兩比較：較卒中1 周組，卒中2 周組IL-1β表達增加，卒中4 周組Iba-1、IL-1β 和IL-18 表達增加（P均＜0.05）；余指標之間比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見圖2。

圖2 5組患側海馬Iba-1、IL-1β及IL-18相對表達的Western blot結果Figure 2 Results of the relative expression of Iba-1,IL-1β and IL-18 in the affected hippocampus of five groups(Western blot)

3.4 5組大鼠患側海馬CA1區Iba-1熒光強度比較

Iba-1 呈現為綠色熒光，細胞核染（DAPI）呈現為藍色熒光。MCAO 術后2 周時，與卒中2 周組比較，應激1周組大鼠患側海馬CA1區Iba-1熒光強度變化不明顯（P＞0.05）。MCAO 術后4 周時，與卒中4 周組比較，應激3 周組患側海馬CA1 區Iba-1 熒光強度顯著增加（P＜0.05）。見圖3。

縱向比較：與應激1 周組比較，應激3 周組大鼠患側海馬Iba-1熒光強度顯著增強（P＜0.05）。卒中組3 個不同時間點患側海馬CA1 區Iba-1 熒光強度差異均有統計學意義（P均＜0.05）；兩兩比較：與卒中1 周或2 周組比較，卒中4 周組患側海馬CA1 區Iba-1熒光強度增強（P均＜0.05）；其余比較，變化不明顯。見圖3。

圖3 5組患側海馬CA1區Iba-1熒光強度比較（×400）Figure 3 Comparison of Iba-1 fluorescence intensity in CA1 region of affected hippocampus in five groups（×400）

4 討論

本研究有以下新的發現：①慢性應激誘導卒中大鼠抑郁樣行為，可能與海馬小膠質細胞及炎癥反應的持續激活有關；②海馬小膠質細胞活化及炎癥反應持續至卒中后4 周；③適度慢性應激不影響缺血性卒中大鼠殘存腦體積比。

CUMS 是基礎研究中用來誘導卒中大鼠抑郁樣行為的常用方法。本研究中，發現應激3 周可使卒中大鼠表現出SPI 下降，NSFT 潛伏期延長，攝食量下降乃至OFT 運動意愿減少等抑郁樣行為，與既往研究一致［5-7］。在分子層面，重點觀察了海馬小膠質細胞表達的時間線特征，結果發現應激組Iba-1 表達不僅較同時間點的卒中組增加，而且應激組內部也呈現出時間相關性增加。這在既往研究中很少被報道。在病理學層面，我們發現CA1 區小膠質細胞活化非常顯著，除卒中4周組外，余綠色熒光強度趨勢與Iba-1 蛋白表達基本一致。本研究再次驗證了海馬小膠質細胞活化在慢性應激誘導卒中大鼠抑郁樣行為中所扮演的重要角色，與前期研究基本一致［8］。

同時，本研究對海馬促炎性細胞因子IL-1β 和IL-18 進行了檢測，發現二者表達趨勢與Iba-1 蛋白表達非常相似，提示促炎性反應與小膠質細胞活化同步。作為具有吞噬功能的中樞常駐免疫細胞，活化的小膠質細胞可通過突觸分枝感受微環境變化。在應激早期，處于M1 極化狀態的小膠質細胞可分泌大量促炎性細胞因子（如IL-6、TNF-α和IL-1β），從而介導抑郁樣行為發展［4］。遺憾的是，本研究中沒有對海馬Iba-1 和炎癥因子進行免疫雙標，尚不能證實海馬區的促炎反應為小膠質細胞源性。

在本研究中，我們還發現隨卒中時程延長，海馬Iba-1 和促炎性細胞因子表達持續增加，提示卒中后海馬小膠質細胞活化和炎癥反應可能是一個持續過程。不過，不同研究的觀點并不一致。THAKKAR 等［9］在全腦缺血的小鼠模型研究中發現，海馬NLRP3 炎癥小體及其下游產物（裂解的Caspase1 和IL-1β）在缺血后1 周達峰值；而在另一組全腦缺血的大鼠模型研究發現［10］，海馬IL-1β 等炎癥標志物在缺血后2周仍然升高。相較于海馬炎癥因子的檢測，對局灶性缺血周邊非海馬區域的檢測也發現IL-1β 等炎癥因子的升高，甚至持續到缺血后7周［11］。這些研究提示卒中后腦組織炎癥反應依據缺血模型不同可能呈現出不同的演變軌跡，甚至轉為慢性炎癥。本研究首次發現海馬小膠質細胞活化及促炎性細胞因子表達在卒中后4周時仍然存在。不過，卒中組大鼠行為學評分并沒有隨炎癥因子水平升高而惡化，間接提示卒中后功能恢復與慢性應激軀體化機制的復雜性。

另外，本研究對腦組織肉眼形態學進行了測量，發現卒中組和應激組患側胼胝體和紋狀體均有萎縮，但是殘存腦體積比差異無統計學意義，這有別于本課題組前期報道［5，12］。原因可能與MCAO 及CUMS 方案調整有關。首先，為降低術后死亡率，腦缺血時間由90 min 減少至70 min；其次，空間限制時間由4 h減至2 h，噪音刺激由20 min減至10 min，夾尾由2 min 減至1 min。其中，腦缺血時間是影響腦梗死體積的主要因素；而空間限制則是增加心理壓力的首選方法。據報道［13-14］，“新冠肺炎”期間居家隔離明顯增加心理負荷，心理咨詢或抑郁傾向人群較平時明顯增加。不過，應激方式的差異是否會影響腦梗死體積變化，有待進一步研究。

當然，本研究也存在以下不足：①慢性應激時間局限于1周與3周，尚缺少其他時間點數據；②缺少小膠質細胞源性炎癥分子通路的深入研究；③未進行物理因子干預。下一步可以利用受體阻斷和免疫雙標的方法，動態觀察海馬小膠質細胞活化與炎癥反應通路介導慢性應激在卒中后抑郁樣行為的生物學機制。

綜上所述，本研究揭示了海馬小膠質細胞活化及炎癥反應介導慢性應激誘導卒中大鼠抑郁樣行為可能具有時間相關性特征，卒中后海馬小膠質細胞活化及炎癥反應可能是一個持續過程，而適度慢性應激可能不影響腦梗死體積。