全基因組測(cè)序技術(shù)在豬源沙門氏菌血清分型和耐藥性分析中的應(yīng)用

張 璐，沈青春，徐錦濤，趙 琪，李 霆，程 敏，張純萍*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.皇譽(yù)寵物食品有限公司，上海 200000)

沙門氏菌是自然界中最常見的人畜共患病原菌，能夠引起仔豬的副傷寒、敗血癥等疾病，而且豬感染后常成為隱性帶菌者，不定期排毒，從而感染其他畜禽。更為重要的是，豬所攜帶的沙門氏菌也是一種重要的食源性病原菌，在我國沙門氏菌食物中毒事件中，90%以上的是由肉類食品引起的，其中豬肉及其產(chǎn)品是主要污染源之一[1]。血清分型是實(shí)現(xiàn)病原體溯源分析的主要方法，但沙門氏菌的血清型眾多，常規(guī)血清分型方法較為繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，且對(duì)于出現(xiàn)交叉凝集或凝集現(xiàn)象不明顯的菌株，結(jié)果較難判斷[2]。沙門氏菌的預(yù)防和治療主要依賴于抗菌藥物，但抗菌藥物的頻繁使用，產(chǎn)生了大量的耐藥菌株。目前細(xì)菌耐藥性已經(jīng)成為全球共同關(guān)注的問題，尤其是在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物的健康，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序成本的大幅降低和多種公共數(shù)據(jù)庫的創(chuàng)建簡(jiǎn)便了沙門氏菌血清分型方法和耐藥性的檢測(cè)[4]。國外研究表明，通過全基因組測(cè)序，可以簡(jiǎn)單、快速和高效的檢測(cè)沙門氏菌的血清型和耐藥基因，且具有較好的敏感性和特異性[5-7]，但目前國內(nèi)相關(guān)文章較少。因此，本文選取了我國2011-2015年不同地區(qū)分離的60株豬沙門氏菌，利用全基因組測(cè)序技術(shù)分析沙門氏菌的血清型和耐藥性，并與常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較，從而分析全基因組測(cè)序技術(shù)(Whole genome sequencing，WGS)在沙門氏菌血清分型和耐藥性分析方面的應(yīng)用能力。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 豬源沙門氏菌共60株，分離時(shí)間為2011-2015年，其中上海14株、四川10株、廣東36株。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC 25922和ATCC 35218，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所安全評(píng)價(jià)室保存。

1.2 主要試劑和儀器 沙門氏菌診斷血清購自丹麥國家血清研究院，革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、上海星佰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，沙門氏菌全基因組測(cè)序分析由奧維森基因科技有限公司完成。

1.3 血清凝集試驗(yàn) 參照沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GBT4789.4-2016[8]，采用傳統(tǒng)玻片凝集法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行血清型鑒定。O抗原的鑒定需要先在潔凈的玻片上滴加1滴診斷血清，然后用潔凈的槍頭挑取營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)的單菌落與O抗原多價(jià)血清充分混勻，晃動(dòng)30～60 s，出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象為陽性反應(yīng)。如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌落在1 mL生理鹽水中做成濃菌液，在酒精燈火焰上煮沸后，若凝集則具有Vi抗原，同時(shí)設(shè)置無菌生理鹽水為對(duì)照，在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。H抗原的鑒定則需挑取swarm半固體瓊脂培養(yǎng)的周邊菌落與H抗原多價(jià)血清充分混勻，觀察凝集現(xiàn)象。最后根據(jù)O相與H相的凝集結(jié)果，查閱WHO的White-Kauffmann-Le Minor抗原表[9]確定血清型。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法對(duì)不同年代沙門氏菌進(jìn)行耐藥性(磺胺異噁唑、氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、四環(huán)素、頭孢噻呋、阿奇霉素、復(fù)方新諾明、粘菌素、恩諾沙星、氟苯尼考、美羅培南)特征分析：挑取2～3個(gè)單菌落置5 mL滅菌生理鹽水中，用0.5麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，調(diào)制菌液濃度為1.5×108cfu/mL左右；取菌液60 μL加入12 mL的藥敏接種培養(yǎng)液中，進(jìn)行混勻稀釋，每孔100 μL，陰性對(duì)照孔單獨(dú)加入100 μL藥敏接種培養(yǎng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20 h。在陰性對(duì)照孔清澈，陽性對(duì)照孔渾濁以及質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍的前提下，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[10]判斷被檢菌株是否耐藥。

1.5 WGS測(cè)序分析

1.5.1 測(cè)序 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取劑盒說明書提取沙門氏菌DNA，DNA濃度高于100 ng/μL后，送公司經(jīng)Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，然后用Trimmomatic(v0.36)[11]軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，使用SPAdes(v3.13.0)[12]軟件參考沙門氏菌P125109(ACCESSION:AM933172、基因組大小為4685848 bp)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。

1.5.2 生物信息學(xué)分析 根據(jù)基因組流行病學(xué)中心網(wǎng)站中SeqSero2血清分型數(shù)據(jù)庫和ResFinder4抗性基因數(shù)據(jù)庫中的基因組信息建庫，采用 CentOS 7.8系統(tǒng)服務(wù)器創(chuàng)建相應(yīng)的血清分型數(shù)據(jù)庫和耐藥基因數(shù)據(jù)庫，分析60株沙門氏菌的WGS 組裝數(shù)據(jù)，分別得到血清分型和耐藥基因攜帶結(jié)果。將WGS分型結(jié)果與常規(guī)血清分型結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)結(jié)果有差異的進(jìn)行再次常規(guī)血清分型驗(yàn)證。對(duì) WGS檢測(cè)的耐藥基因，使用 identity>90.0%，coverage>90.0%的閾值運(yùn)行命令，進(jìn)行基因型與耐藥表型進(jìn)行對(duì)比分析[13]。

2 結(jié)果及分析

2.1 全基因組測(cè)序、組裝結(jié)果 經(jīng)Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)序和Trimmomatic軟件質(zhì)控后，共得到約77.59 Gb的原始數(shù)據(jù)，組裝后的60株沙門氏菌的基因組大小在4648280～ 13443523 bp之間，GC含量為45.32%～52.24%，具體結(jié)果見表1。

表1 60株豬源沙門氏菌全基因組序列基本特征Table 1 The basic characteristics of whole genome sequence of 60 Salmonella strains from pigs

2.2 血清凝集分型與全基因組分型結(jié)果比較 60株沙門氏菌通過血清凝集試驗(yàn)共鑒定出8種血清型，主要血清型為鼠傷寒和德爾卑；WGS分型共鑒定出9種血清型，優(yōu)勢(shì)血清型與常規(guī)血清分型結(jié)果一致；兩種方法共有54株分型結(jié)果一致，符合率為90.0%，具體分型結(jié)果見表2。

表2 常規(guī)血清分型與全基因組分型結(jié)果Tab 2 Results of routine serotyping and whole genome typing

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 沙門氏菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥性情況詳見表3。結(jié)果表明，豬源沙門氏菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥情況差異較大，其中對(duì)美羅培南、頭孢噻呋、阿奇霉素和粘菌素均為敏感，而對(duì)四環(huán)素、氨芐西林等7種抗菌藥物均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，尤其是對(duì)四環(huán)素(73.3%)的耐藥水平明顯高于其他抗菌藥物。

表3 60株沙門氏菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥情況Tab 3 Antimicrobial resistance of 60 Salmonella strains to 11 antimicrobial agents

2.4 全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)沙門氏菌的耐藥基因型 基于60株沙門氏菌的WGS測(cè)序結(jié)果，使用抗性基因數(shù)據(jù)庫ResFinder4分析獲得的耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺類(blaTEM-1、blaOXA-1)、四環(huán)素類(tetA和tetB)、磺胺類(sul1、sul2和sul3)、喹諾酮類(oqxA、oqxB和qnrS2)和酰胺醇類(floR)。

通過比較，WGS預(yù)測(cè)的沙門氏菌耐藥性與藥敏試驗(yàn)結(jié)果的符合率較高，其中對(duì)恩諾沙星、美羅培南、頭孢噻呋和阿奇霉素預(yù)測(cè)的結(jié)果完全一致；對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑、四環(huán)素預(yù)測(cè)的結(jié)果符合率均高于90.0%，對(duì)復(fù)方新諾明、氟苯尼考、阿莫西林/克拉維酸預(yù)測(cè)符合率也大于75%，具體結(jié)果詳見表4。

表4 沙門氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果與全基因組測(cè)序結(jié)果的比較Tab 4 Comparison of antimicrobial sensitivity test results and whole genome sequencing results of Salmonella

3 討論與結(jié)論

隨著全基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息分析方法的不斷進(jìn)步，測(cè)序時(shí)間與成本的不斷降低，使得公共數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)了大量的病原菌基因組序列，極大提升了細(xì)菌基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可用性。與此同時(shí)，簡(jiǎn)便易用的在線數(shù)據(jù)分析與可視化工具也在不斷問世，如血清分型數(shù)據(jù)庫SeqSero2和耐藥基因數(shù)據(jù)庫ResFinder4，二者均可通過CGE網(wǎng)站直接上傳WGS組裝序列，即可預(yù)測(cè)相應(yīng)的血清型和耐藥基因，簡(jiǎn)便了操作流程[14-15]。

本研究利用SeqSero2分析獲得的血清型結(jié)果與常規(guī)分型結(jié)果的符合率為90.0%，這與他人的研究結(jié)果基本一致。如BANERJI等[16]的研究中，WGS預(yù)測(cè)520株沙門氏菌血清型結(jié)果與原始分型結(jié)果的符合率為98.0%。DIEP等[17]研究的98株沙門氏菌的血清型與常規(guī)分型結(jié)果的符合率為98.0%。在兩種分型結(jié)果不一致的血清型中，大部分是需要特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)和多種血清鑒定的罕見血清型，如奧蘭、奧茲馬斯等。這可能是因?yàn)槌Ｒ?guī)血清分型結(jié)果的判讀會(huì)因個(gè)人判讀標(biāo)準(zhǔn)不同而產(chǎn)生差異，亦或者是由于H相抗原基因中的等位基因在相變機(jī)制中發(fā)生突變而不表達(dá)而產(chǎn)生不一致的結(jié)果[18]。

為評(píng)估WGS在沙門氏菌抗菌藥物耐藥性中的鑒定能力，應(yīng)用ResFinder4抗性基因數(shù)據(jù)庫分析沙門氏菌所攜帶的耐藥基因，從耐藥基因的攜帶推斷抗菌藥物的耐藥性來看，應(yīng)用WGS預(yù)測(cè)的恩諾沙星、美羅培南、頭孢噻呋和阿奇霉素的耐藥性與藥敏試驗(yàn)結(jié)果完全一致，對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑、四環(huán)素預(yù)測(cè)的結(jié)果符合率也均大于90.0%。ZANKARI等[19]通過WGS預(yù)測(cè)的49株鼠傷寒沙門氏菌基因型與表型藥敏試驗(yàn)的結(jié)果完全一致。ZHU等[20]對(duì)189株沙門氏菌的耐藥性檢測(cè)中，WGS預(yù)測(cè)的磺胺異噁唑、氨芐西林和四環(huán)素的耐藥性與其耐藥表型的符合率分別為97.8%、94.6%和85.7%。NEUERT等[20]研究的3415株沙門氏菌對(duì)15種抗菌藥物的表型耐藥性與基因型耐藥性結(jié)果的符合率為97.8%。目前WGS 只能檢測(cè)到質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，而對(duì)于染色體突變產(chǎn)生的耐藥基因無法檢出。在對(duì)阿莫西林/克拉維酸耐藥基因型檢測(cè)中，可能由于基因組測(cè)序過程中部分區(qū)域的覆蓋率較低，阻止了突變位點(diǎn)的檢測(cè)，亦或者出現(xiàn)了新的耐藥基因突變，從而出現(xiàn)了表型與基因型的符合率相對(duì)較低的結(jié)果[21]。

基于全基因組數(shù)據(jù)分析的沙門氏菌血清分型和耐藥性方法具有操作簡(jiǎn)便、效率高的優(yōu)勢(shì)，可以在常規(guī)血清凝集試驗(yàn)難以開展或沙門氏菌鞭毛基因不表達(dá)的情況下，替代血清凝集試驗(yàn)，也可快速識(shí)別菌株攜帶的所有耐藥基因。為解決沙門氏菌耐藥性問題提供重要參考，在沙門氏菌流行病學(xué)的研究中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。