水平潛流人工濕地堵塞初期微生物群落結構變化

張明珍 曹濤濤 劉 偉 李前正 胡 澤 陳迪松吳振斌 徐 棟

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049;3.中國地質大學環境學院, 武漢 430074; 4.武漢市生態環境科技中心, 武漢 430015)

水平潛流人工濕地(HFCWs)作為一種污水處理技術, 兼有效性、經濟性及觀賞性, 因此被廣泛用于工業廢水、生活污水、農業尾水及城市地表徑流的凈化處理中[1—3]。然而, 大量的工程實踐表明, 隨著人工濕地運行時間的增加, 內部會出現不同程度的堵塞。一般來說, 濕地堵塞過程主要是濕地填料內有效孔隙逐漸減少、滲透系數緩慢下降的過程, 大致可歸結為物理、化學和生物三方面的原因: (1)物理機理: 濕地進水中的有機、無機懸浮物和難降解有機物沉積在濕地表面、基質顆粒之間及基質顆粒內, 使基質孔隙逐漸減小; (2)化學機理: 基質和基質中水相的物理化學性質造成濕地堵塞, 比如基質的化學組成和孔隙率、水相的有機物組成、pH和氧化還原電位等; (3)生物機理: 微生物利用濕地內積累的有機物, 迅速生長形成大量的胞外聚合物, 滲透系數緩慢下降, 該物質還可與多糖類、聚脲類等物質形成低密度的孔徑為納米級的凝膠網狀結構, 攔截無機和有機顆粒物, 使滲透系數下降到堵塞的程度[4—6]。

這三種機理共同作用, 使人工濕地短流或表面雍水, 最終影響濕地處理效率甚至縮短其使用年限[7,8]。因此, 為了避免上述情況發生, 對人工濕地運行過程的堵塞狀況進行監測至關重要。

目前, 人工濕地堵塞的判定方法主要是基于水力傳導率或污染物去除效率的變化[9], 通常分為三個階段: 第一階段即堵塞初期階段, 基質滲透系數呈下降趨勢, 但其值仍然與初始滲透系數接近; 第二階段即堵塞中期階段, 滲透系數大幅度下降; 第三階段即堵塞后期階段, 滲透系數趨于平穩, 并出現明顯的堵塞現象, 包括濕地表面雍水及處理效率降低等[10]。事實上, 微生物在人工濕地污染物的去除以及其生物地球化學循環過程中起著關鍵作用,任何功能微生物的變化都與濕地內部的生化反應相關聯, 從而反映人工濕地的運行狀態[11]。有學者利用高通量測序技術來表征垂直流人工濕地柱在運行過程中細菌群落結構變化, 其結果表明隨著濕地柱堵塞程度的增加, 細菌群落的豐富度和多樣性都降低[9]。但是很少有研究探索具體的微生物類群作為“指示物”來預報HFCWs早期堵塞的發生。本研究通過運行不同組的水平潛流人工濕地反應器來模擬濕地堵塞初期過程并研究其中微生物群落結構與組成的變化, 以期找出該階段的特征微生物類群, 為堵塞人工濕地微生物監測指標的研發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置及運行

實驗系統由4組尺寸相同(長×寬×高=100 cm×50 cm×70 cm)的水平潛流人工濕地反應器組成(B0為未種植植物, B1為種植美人蕉, B2為種植菖蒲, B3為種植香蒲; 圖1), 其中a—c: a為84d和166d時未種植植物的濕地反應器B0的基質采樣點(B0in-84和B0in-166); b為84d和166d時4組濕地反應器的基質采樣點(B0mid-84、B1-84、B2-84、B3-84、B0mid-166、B1-166、B2-166和B3-166); c為84d和166d時未種植植物的濕地反應器B0的基質采樣點(B0out-84和B0out-166)。

圖1 水平潛流濕地反應器裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of horizontal subsurface flow wetland reactors

本研究人工濕地反應器中的植物取自已建成并穩定運行的人工濕地公園, 每株植物株高和分支近似(種植密度為20株/m2)。進水采用自配污水來模擬生活污水, 參考Prochaska等[12]的方法制備。此外, 為盡可能地還原水平潛流人工濕地堵塞的過程,實驗進水中添加適量的粉煤灰代替生活污水中的懸浮物。本實驗在室外實驗基地中進行, 運行時間為2019年6月22日至2019年12月30日; 所有濕地系統均間歇運行, 水力負荷為0.0625 m3/(m2·d)。在濕地運行期間白天室外溫度不低于10℃, 人工濕地系統中大部分的硝化與反硝化細菌可以在該環境溫度下良好生長[13], 所以本研究中排除溫度對主要功能微生物生長的影響。本研究采用基質過濾速率的變化作為人工濕地反應器進入堵塞初期的判定方式。

1.2 采樣

為避免植物根系對微生物的影響, 以便于各濕地反應器微生物群落結構的差異性比較, 未種植植物的人工濕地反應器(B0)的基質采樣點為濕地表面向下25 cm的3個區域, 包括濕地水力沿程方向上的10—20 cm、45—55 cm和80—90 cm(如圖1所示依次為a、b、c三個點位); 對于3組種植植物的人工濕地反應器, 于同一深度, 從根際區域(如圖1所示b點位)采集基質樣品。樣品在現場采集后放入有冰塊保溫箱中暫存, 隨后立即轉移至實驗室-80℃超低溫冰箱中保存。

1.3 DNA 提取、高通量測序及數據分析

基質樣品中的DNA用美國Omega公司的Mag-Bind Soil DNA分離試劑盒提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取細菌總DNA, 并使用Qubit 3.0(LIFE,USA)對DNA的濃度進行定量, 以確保提取了足夠數量的高質量基因組。本研究選擇16S rDNA V3-V4可變區片段進行PCR擴增, 引物序列為341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-GACT ACHVGGGTATCTAATCC-3')。擴增條件為: 95℃變性3min; 95℃變性30s, 45℃退火30s, 72℃延伸30s, 擴增5個循環; 然后95℃變性20s, 55℃退火30s,72℃延伸30s, 擴增20個循環; 最后72℃延伸5min。擴增后PCR產物經純化后, 由生工生物工程(上海)股份有限公司進行MiSeq(Illumina)高通量測序并基于Mothur 1.30對原始序列進行校正, 得到優化序列。本研究在97%的相似水平下對優化序列進行OTU(可操作分類單元, Operational Taxonomic Units)劃分, 確定α-多樣性指數(Chao1多樣性指數、Shannon-Wiener多樣性指數和克隆覆蓋率); 使用Origin 2018 和GraPhlAn 0.9.7繪制圖形; 最后利用Fisher’s exact test來分析樣本間微生物豐度差異。

2 結果

2.1 人工濕地水力特性與凈化性能變化

在本研究中, 各組水平潛流人工濕地反應器的基質過濾速率與污染物去除效率變化如圖2所示。從圖2a看出, 隨著運行時間的增加, 4組水平潛流人工濕地反應器的基質過濾速率持續下降: 未種植植物的濕地反應器(B0)下降了18%; 種植美人蕉、菖蒲和香蒲的濕地反應器(B1、B2和B3)分別下降了14%、15%和13%。此外, 從圖2b—d看出, 在整個實驗過程中, 4種濕地系統中的COD和TN去除效率分別穩定在50%—85%和10%—20%, 而TP去除效率從大約60%持續下降到約5%。

圖2 不同水平潛流人工濕地反應器在堵塞過程中總體性能變化Fig.2 The variation of overall performance in four HFCW reactors during the clogging process

2.2 細菌群落的α-多樣性分析

在堵塞形成過程中, 不同水平潛流人工濕地反應器中細菌群落的α-多樣性分析結果如表1所示:每個樣品覆蓋率均在0.99以上, 表明測序對樣品覆蓋度較高; 通過高通量測序分析12個基質樣品共得到31679個OTU, 且堵塞前的OTU數大于堵塞初期的OTU數; 12個基質樣品的Chao1多樣性指數在2596.60—4659.16, 具體表現為在植物組人工濕地反應器(B1、B2和B3)中, 堵塞前的Chao 1值大于堵塞初期的Chao 1值, 而在未種植植物的濕地反應器(B0)中, 布水區域的Chao 1值與植物組濕地反應器表現出相同的趨勢, 而中心區域和集水區域的Chao 1值則呈現相反的結果; 12個基質樣品的Shannon-Wiener 多樣性指數在4.86—6.05且變化趨勢與Chao1多樣性的變化趨勢相類似。此外, 在本研究中植物組濕地反應器的Chao 1和Shannon-Wiener多樣性指數值都高于未種植植物濕地反應器的Chao 1和Shannon-Wiener 多樣性指數值。

表1 不同水平潛流人工濕地反應器中12個基質樣品細菌群落豐富度和多樣性分析Tab.1 The richness and diversity of bacterial community for twelve samples collected from different HFCW reactors

2.3 優勢細菌菌群變化

門類水平本研究通過對12個基質樣品進行16S rDNA測序分析共得到33個細菌門, 以相對豐度 ＞1% 定義為優勢菌門并比較其組成及相對豐度。從圖3可以看出在整個運行過程中, 4個人工濕地反應器的優勢菌門始終為變形菌門(Proteobacteria, 25.78%—54.96%)、厚壁菌門(Firmicutes,7.97%—24.79%)、綠彎菌門(Chloroflexi, 5.67%—17.33%)、擬桿菌門(Bacteroidetes, 3.98%—16.02%)、Parcubacteria(2.4%—8.06%)、放線菌門(Actinobacteria, 1.53%—4.42%)、浮霉菌門(Planctomycetes,0.62%—5.51%)、Candidatus Saccharibacteria(1.22%—3.35%)、酸桿菌門(Acidobacteria, 1.66%—9.17%)和疣微菌門(Verrucomicrobia, 0.59%—1.69%); 但當4種人工濕地反應器相繼發生堵塞后, 除變形菌門豐度明顯增加以外(P＜0.001), 其他優勢菌門的豐度均呈下降趨勢(P＜0.05), 酸桿菌門和疣微菌門尤其明顯。

圖3 不同水平潛流人工濕地反應器在堵塞過程中優勢菌門的組成及其相對豐度Fig.3 The composition and relative abundance of dominant bacteria phyla in different HFCW reactors during clogging development (%)

屬類水平本研究中12個基質樣品通過高通量測序分析共得到458個細菌屬, 以其相對豐度前20作圖4, 從中可以看出主要優勢菌屬包括Ornatilinea(1.89%—11.27%)、Thauera(0.05%—11.38%)、Rhizobium(0.54%—13.57%)、Parcubacteria_genera_incertae_sedis(2.4%—8.06%)、Rhodobacter(0.38%—5.36%)、Clostridium_sensu_stricto(0.54%—4.48%)、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis(1.22%—3.35%)、Rhodopseudomonas(0.09%—7.28%)、Anaerovorax(0.6%—3.25%)、Levilinea(0.27%—3.53%)、Comamonas(0.32%—0.45%)、Thermomonas(0.46%—2.76%)、Longilinea(0.29%—3.13%)、Terrimonas(0.26%—3.68%)、Shinella(0.49%—2.35%)、Simplicispira(0.11%—5.83%)、Gracilibacter(0.06%—6.31%)、Holophaga(0.13%—5.64%)、Zoogloea(0.03%—3.84%)和Desulfovibrio(0.58%—1.69%)。

圖4 不同水平潛流人工濕地反應器在堵塞過程中優勢菌屬的組成及其相對豐度Fig.4 The composition and relative abundance of dominant bacteria genera in different HFCW reactors during clogging development (%)

從圖5可以看出, 約有一半的優勢菌屬于變形菌門, 如L:SimplicispiraM:ComamonasN:ZoogloeaO:ThaueraP:RhodopseudomonasQ:ShinellaR:RhizobiumS:RhodobacterT:ThermomonasU:Desulfovibrio, 其中, 隨著堵塞的形成, 4組人工濕地系統中的Thauera、Zoogloea和Rhizobium菌屬的相對豐度明顯增加(P＜0.05);Simplicispira菌屬在未種植植物的人工濕地反應器(B0)中明顯增加(P＜0.05)。Clostridiumsensu stricto 和Gracilibacter屬于厚壁菌門(Firmicutes),Levilinea菌屬屬于綠彎菌門(Chloroflexi); 在本研究中, 這3種菌屬的相對豐度在4組人工濕地反應器堵塞后明顯增加(P＜0.05)。此外, 本研究中Holophaga為酸桿菌門(Acidobacteria)下豐度最高的菌屬, 其豐度變化趨勢與酸桿菌門一致, 均為隨著堵塞的形成, 其相對豐度明顯下降(P＜0.05)。

圖5 12個基質樣品中優勢物種分類和系統發育信息可視化圖Fig.5 Visualization of classification and phylogenetic tree of dominant genera in bacterial communities detected from twelve samples

3 討論

3.1 人工濕地水力特性與凈化性能變化

本研究根據基質過濾速率的變化來確定基質采樣時間。基質樣品的第一次采集定在濕地反應器運行至第84天, 這是因為有研究表明人工濕地運行至75—100d時人工濕地中的微生物群落已達到穩定狀態[14,15]; 樣品的第二次采集定為濕地反應器運行至第166天, 此時4組人工濕地的基質過濾速率下降了13%—18%, 符合濕地堵塞初期階段的描述,說明本實驗濕地系統確已進入堵塞初期。此外, 本研究中4組人工濕地反應器的COD和TN去除效率始終穩定在一定范圍內, 即使進入堵塞初期, 這兩者的去除效率仍沒有顯著變化, 這與Vymazal[8]的研究結論一致, 即局部堵塞對水平潛流人工濕地污染物的去除效果沒有顯著影響; 而TP的去除效率持續下降, 這說明本實驗中濕地除磷的主要機理是基質的吸附作用, 而非植物吸收以及微生物的降解作用[16]。

3.2 微生物群落結構及多樣性分析

Chao1和Shannon-Wiener 多樣性指數分別反映細菌群落的豐富度和多樣性[17], 其結果表明, 水平潛流人工濕地反應器堵塞后細菌的豐富度和多樣性會降低, 這與華國芬等[9]的研究結果是一致的。此外, 植物組人工濕地反應器的Chao 1值和Shannon-Wiener 多樣性指數值都高于未種植植物濕地反應器的多樣性指數值, 這可能是因為植物根系的存在會增加細菌的豐富性和多樣性[18,19]。

3.3 微生物門水平和屬水平差異分析

本研究中微生物門水平和屬水平上的測序結果表明, 在整個實驗過程中, 變形菌門的物種豐度明顯高于其他微生物豐度, 此研究結果與之前人工濕地微生物的研究一致[20,21]; 同時當4組人工濕地反應器進入堵塞初期階段時, 變形菌門豐度變化最明顯, 具體表現為其門下的反硝化菌屬豐度增加:Thauera是一類好氧反硝化細菌屬, 其相對豐度明顯增加是因為濕地堵塞會導致溶解氧(DO)下降, 而Thauera可以在低DO環境中生存并參與厭氧反硝化作用[22];Zoogloea是一類好氧反硝化菌屬[23], 其相對豐度在濕地反應器堵塞后明顯增加, 說明該菌屬在堵塞后的人工濕地系統中具有較強的適應性;有研究表明Rhizobium是一種自養反硝化菌屬, 主要參與-N的去除過程[24]。在濕地堵塞后, 其內部出現許多厭氧或缺氧的微環境, 便于Rhizobium生長, 所以該菌屬的豐度在4組人工濕地反應器進入堵塞初期后明顯增加; 異養反硝化細菌屬Simplicispira在未種植植物的人工濕地反應器中明顯增加,這是因為該類菌屬可以在長期厭氧的環境下生長[25]。

除反硝化細菌外, 有機物降解菌也是人工濕地生態系統中一類重要的功能菌。有研究表明厚壁菌門下的Clostridiumsensu stricto 和Gracilibacter在各生態系統中可以降解有機物[26,27]。在本研究中, 隨著堵塞的形成與發展, 4種人工濕地反應器中的Clostridiumsensu stricto和Gracilibacter的相對豐度明顯增加, 這是因為在人工濕地堵塞后, 濕地內部積累了大量的有機物質, 從而為這類細菌的生長提供足夠的碳源。此外, 綠彎菌門下的Levilinea可以將碳水化合物轉化為有機酸, 因此在本研究中的4種濕地反應器堵塞后其相對豐度顯著增加[28]。

王光華等[29]的研究表明, 濕地中的酸桿菌門可以降解植物殘體多聚物(如纖維素)及參與單碳化合物的代謝過程, 但本研究中酸桿菌門在有植物組濕地中的豐度卻低于在無植物組濕地中的豐度, 這表明堵塞會影響酸桿菌門的微生物生長。此外,Holophaga為酸桿菌門下豐度最高的菌屬, 其豐度變化趨勢與酸桿菌門一致, 這進一步說明了堵塞影響酸桿菌門微生物生長的實質是影響其門下的Holophaga生長。

4 結論

本研究結果分析表明: (1)水平潛流人工濕地反應器堵塞后細菌的豐富度和多樣性會降低; (2)人工濕地系統中的優勢菌門主要是變形菌門, 且在堵塞初期變形菌門相對豐度明顯增加, 具體表現為其門下的反硝化細菌屬(Thauera、Zoogloea和Rhizobium)豐度顯著增加, 此外在此階段厚壁菌門和綠彎菌門下的有機物降解菌屬(Clostridiumsensu stricto、Gracilibacter和Levilinea)豐度也顯著增加;(3)隨著堵塞的形成與發展, 酸桿菌門下的主要菌屬Holophaga豐度顯著下降。上述結果說明人工濕地系統中的反硝化細菌屬(Thauera、Zoogloea和Rhizobium)、有機物降解菌屬(Clostridiumsensu stricto、Gracilibacter和Levilinea)可作為堵塞發生的早期預警, 而Holophaga的指示作用有待進一步的深入研究。此外, 當前微生物測序技術的成本較高、用時相對較長, 限制了微生物監測方法的發展與應用, 因此將能夠指示濕地堵塞的特異菌屬的變化轉化為其他便于監測的信號是我們未來研究的重點。

致謝:

感謝上海生工生物工程有限公司何雨蓉工程師在微生物數據分析方面提供的指導, 感謝課題組邱東茹老師、張義老師、王來博士、王川博士、嚴攀同學等在實驗方案設計及數據分析方面提的意見和建議。