微小RNA-199a-5p調控Klotho表達對體外腦缺血再灌注大鼠氧-葡萄糖剝奪/再灌注誘導的腎上腺嗜鉻瘤細胞損傷的保護作用

王小亞，杜旭輝，何曉剛

作者單位：1平頂山市第二人民醫院神經內科，河南 平頂山 467000；2許昌市中心醫院神經內科，河南 許昌 461000

腦缺血被認為是全世界腦血管疾病高發病率和高死亡率的主要原因［1］。盡管再灌注是有效治療腦缺血的可行療法，但它也可能在稱為腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的過程中加劇腦損傷和功能損傷［2］。近年來，大量的研究表明，涉及多種信號途徑和生物學過程的多種機制參與腦I/R損傷；然而，其機制復雜，目前對這方面的認識還不盡如人意。許多研究證實，氧化應激和炎癥反應是腦I/R后神經元丟失的主要病理原因［3-4］。因此，關注與氧化應激相關的分子機制和腦I/R損傷背后的炎癥反應可能會促進更有效的治療藥物的開發。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，可以廣泛調節腦缺血的生物過程，包括氧化應激和炎癥反應。有人提出，miRNA可能是腦缺血的潛在診斷標志物和有前途的治療劑［5］。據報道，miR-199a-5p在缺血性中風大鼠模型中高表達，沉默miR-199a-5p后，大鼠的認知功能明顯改善，腦梗死面積明顯減少，神經細胞凋亡受到抑制，證實了沉默miR-199a-5p對缺血性中風大鼠認知功能和神經元的保護作用［6］。已知，miRNA通過調節下游靶基因發揮作用，通過生物信息學預測發現miR-199a-5p與Klotho之間存在結合位點。Klotho是一種具有多效性的抗衰老基因。據之前研究報道，Klotho可能作為一種內源性神經保護因子對抗缺血損傷，敲低Klotho加劇了小鼠神經功能障礙和腦損傷，證實了Klotho本身或Klotho的增強劑可能是預防和治療老年急性缺血性腦損傷的一種有前途的方法［7］。然而，miR-199a-5p在腦I/R損傷中的潛在保護機制以及Klotho在其中發揮的作用仍有待闡明。

本研究自2021年5―11月通過構建神經元PC12細胞的氧-葡萄糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷模型模擬體內腦I/R損傷條件，旨在研究抑制miR-199a-5p對OGD/R損傷PC12細胞氧化應激和炎癥反應的保護作用，以及Klotho在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞PC12（未分化）（貨號YS3032C）獲自美國ATCC。馬血清（貨號26050088）、胎牛血清（貨號10100147）、青霉素-鏈霉素（貨號15070063）獲自美國Gibco；DMEM培養基（貨號D6046）獲自德國MERCK，miR-199a-5p模擬物/抑制劑（miR-199a-5p mimics/inhibitor）及其陰性對照（miR-NC mimics/inhibitor）、Klotho敲低載體質粒（shRNA-Klotho）及其對照載體質粒（shRNApLKO.1）、3'-UTR Klotho野生型載體質粒（Klotho-WT）及3'-UTR Klotho突 變型載體 質粒（Klotho-MUT）均由上海GenenPharma提供；TRIzol試劑（貨號15596026）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號BMS622）、白細胞介素-1β（IL-1β）（貨號ERIL1B）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）（貨號BMS631INST）和白細胞介素-6（IL-6）（貨號BMS625）ELISA試劑盒獲自美國Invitrogen；HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號R211-01）獲自南京VAZYME；Arraystar SYBR?Green Real-time qPCR Master Mix（貨號AS-MR-005-5）獲自上海Arraystar；RIPA裂解緩沖液（貨號89900）獲自美國Thermo Scientific；一抗Klotho（貨號YB-2925R，113 kDa）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（貨號YB-01000，37 kDa）獲自上海鈺博生物科技；膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）細胞增殖試劑盒獲自美國BestBio；Annexin V-FITC／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（貨號FY600003-20T）獲自上海Fuyuanbio；活性氧（ROS）檢測試劑盒（貨號：S0033M）獲自上海Beyotime；大鼠丙二醛（MDA）含量［貨號JK-（a）-2197］、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性［貨號JK-（a）-2396］、超氧化物歧化酶（SOD）活性［貨號JK-（a）-2293］測定試劑盒獲自上海晶抗。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號11402ES60）獲自上海Yeasen。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養PC12細胞系維持在DMEM培養基中，補充有10%馬血清、5%胎牛血清、青霉素（100 mg/L）-鏈霉素（100 mg/L），在含有95%空氣和5%二氧化碳的37℃加濕培養箱中培養。所有處理均在匯合超過80%的細胞進行。

1.2.2 細胞處理與轉染將PC12細胞分為Control組、OGD/R組、miR-NC inhibitor組、miR-199a-5p inhibitor組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組和miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組。Control組細胞不做任何處理；OGD/R組進行OGD/R處理；其余四組細胞按照Lipofectamine 2000試劑盒方法對 應 轉 染miR-NC inhibitor、miR-199a-5p inhibitor、shRNA-pLKO.1或shRNA-Klotho，轉染48 h后進 行OGD/R處理，通過RT-qPCR或Western blotting確定轉染效率。

PC12細 胞OGD/R處 理［8］如 下：PC12細 胞 的DMEM培養基更換為DMEM無糖培養基并轉移到缺氧室（95%N2和5%二氧化碳）中3 h，消耗細胞內外葡萄糖和氧氣。在OGD階段結束時，將培養基更換為含有4.5 g/L葡萄糖的培養基，并在正常培養環境中培養24 h以復氧，各組設置6個復孔，檢測各項指標。

1.2.3 RT-qPCR檢測PC12細胞 中miR-199a-5p和Klotho mRNA表達水平PC12細胞中總RNA通過TRIzol試劑獲取，使用cDNA合成試劑盒將全部的總RNA逆轉錄為cDNA。隨后通過SYBR? Green Real-time qPCR Master Mix進行RT-qPCR。U6作為內參對照基因，2-ΔΔCt法計算目的基因表達。

引物由北京擎科生物科技有限公司參與合成，引物序列如下：miR-199a-5p：5'-GCCAAGCCCAGTGTTCAGAC-3'（正向）和5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'（反向）；Klotho：5'-TGAGGACGACCAGCTGAGGGT-3'（正向）和5'-CATGGATGCCTTGGGCTCAAA-3'（反向）；GAPDH：5'-AAAAGCATCACCCGGAGGAGAA-3'（正 向）和5'-AAGGAAATGAATGGGCAGCCG-3'（反 向）；U6：5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'（正向）和5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'（反向）。

1.2.4 Western blotting分析PC12細胞中Klotho蛋白水平通過RIPA裂解緩沖液從各組PC12細胞中獲得總蛋白質。通過在10% SDS-PAGE（30微克/泳道）分離蛋白質，并遷移到PVDF膜上，于室溫下在5%脫脂牛奶封閉2 h。將膜與一抗Klotho和GAPDH在4℃下過夜孵育。一抗孵育后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h，使用ECL蛋白印跡底物試劑盒顯影。Image J軟件用于進行灰度值分析。

1.2.5 CCK-8測定PC12細胞活力將上述各組轉染處理的PC12細胞按每孔1×106個接種在96孔板中，培養24 h后，每孔中添加10 μL的CCK-8溶液在37℃下孵育3 h，然后在酶標儀上測量發射波長為450 nm的光密度（optical density，OD）值。

1.2.6 流式細胞儀測定PC12細胞凋亡率收集按照上述轉染處理的各組PC12細胞，重懸于緩沖液中，依次添加50 μL Annexin V-FITC和10 μL PI在37℃下染色15 min。使用流式細胞儀評估凋亡細胞，并使用Cell Quest 5.1軟件分析數據。

1.2.7 PC12細胞中ROS生成測定將上述各組轉染處理的PC12細胞按每孔1×106個接種在6孔板中，添加DCFH-DA（10 μmol/L）在37℃下培養20 min。然后收集細胞并使用流式細胞儀量化每組的熒光強度（fluorescence intensity，FI），通過FlowJo軟件分析數據。

1.2.8 PC12細胞中氧化應激指標的測定將按照上述方法轉染處理的各組PC12細胞經裂解后離心以收集上清液。根據試劑盒的方案，使用相應試劑盒評估上清液中MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。

1.2.9 ELISA檢測PC12細胞中炎癥因子水平將按照上述方法轉染處理的各組PC12細胞經裂解后離心以收集上清液。根據試劑盒的方案，使用相應的ELISA試劑盒檢測PC12細胞上清液中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平。

1.2.10 雙熒光素酶驗證PC12細胞中miR-199a-5p與Klotho靶 向 關 系Targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_71/，Release 7.2）網站預測顯示miR-199a-5p與Klotho之間存在潛在結合位點。將Klotho-WT和Klotho-MUT克隆到pmirGLO報告質粒載體中，與miR-199a-5p mimics或miR-NC mimics一起通過Lipofectamine 2000轉染試劑共轉染到PC12細胞中。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測相對熒光素酶活性。熒光素酶活性標準化為海腎熒光素酶活性。

1.3 統計學方法使用SPSS 22.0分析數據，符合正態分布的計量資料采用以±s表示，兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PC12細胞轉染效率驗證RT-qPCR和Western blotting結果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細胞中miR-199a-5p表達水平增高，Klotho mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組 相 比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細 胞 中miR-199a-5p表達水平降低，Klotho mRNA和蛋白水平增高（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNApLKO.1組 相 比，miR-199a-5p inhibitor+shRNAKlotho組PC12細胞中miR-199a-5p表達水平增高，Klotho mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組 與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組 與miR-199a-5p inhibitor組PC12細 胞中miR-199a-5p和Klotho表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1，表1。

表1 各組PC12細胞中miR-199a-5p和Klotho表達水平/±s

表1 各組PC12細胞中miR-199a-5p和Klotho表達水平/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho F值P值重復次數6 6 6 6 6 6 miR-199a-5p 1.03±0.05 3.52±0.27①3.19±0.22①1.61±0.13①②③1.69±0.15①②③2.56±0.18①②③④⑤176.78＜0.001 Klotho mRNA 1.05±0.04 0.24±0.02①0.25±0.03①0.68±0.07①②③0.73±0.06①②③0.40±0.04①②③④⑤281.07＜0.001 Klotho protein 1.26±0.10 0.35±0.04①0.41±0.03①0.79±0.07①②③0.86±0.06①②③0.51±0.05①②③④⑤180.75＜0.001

圖1 蛋白質印跡法檢測各組PC12細胞中Klotho蛋白水平

2.2 各組PC12細胞活力及凋亡情況CCK-8和流式細胞術結果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細胞活力降低，細胞凋亡率增高（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組 相 比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細胞活力增高，細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組相比，miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組PC12細胞活力降低，細胞凋亡率增高（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組與miR-199a-5p inhibitor組PC12細胞活力和細胞凋亡率差異無統計學意義P＞0.05）。見表2。

表2 各組PC12細胞活力與凋亡情況/±s

表2 各組PC12細胞活力與凋亡情況/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho F值P值重復次數6 6 6 6 6 6細胞活力（OD）0.82±0.05 0.37±0.03①0.40±0.02①0.63±0.05①②③0.67±0.06①②③0.52±0.04①②③④⑤92.34＜0.001凋亡率/%7.25±1.03 45.36±3.58①40.33±3.09①15.36±1.24①②③16.84±1.55①②③27.58±2.16①②③④⑤253.90＜0.001

2.3 各組PC12細胞氧化應激情況結果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細胞中ROS釋放量和MDA含量增多，SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組相比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細胞中ROS釋放量和MDA含 量 降低，SOD和GSH-Px活性升高（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組相比，miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組PC12細胞中ROS釋放量 和MDA含量增多，SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組 與miR-199a-5p inhibitor組PC12細 胞 中ROS釋 放 量、MDA含 量 以 及SOD和GSH-Px活性變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組PC12細胞中活性氧（ROS）釋放量與丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平/±s

表3 各組PC12細胞中活性氧（ROS）釋放量與丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho重復次數6 6 6 6 6 6 ROS釋放量1.00±0.00 2.59±0.18①2.41±0.17①1.66±0.10①②③1.73±0.12①②③2.07±0.15①②③④⑤MDA/（μmol/L）3.89±0.25 11.16±0.93①10.98±0.86①6.78±0.59①②③6.20±0.51①②③8.56±0.72①②③④⑤SOD/（U/mL）15.36±2.04 4.02±0.41①4.36±0.48①10.67±1.15①②③9.87±0.86①②③7.15±0.69①②③④⑤GSH-Px/（U/mL）17.16±1.87 6.34±0.57①5.67±0.48①13.05±1.18①②③11.98±1.13①②③9.16±0.78①②③④⑤F值P值110.53＜0.001 105.08＜0.001 93.97＜0.001 93.77＜0.001

2.4 各組PC12細胞炎癥反應情況結果顯示，與Control組相比，OGD/R組PC12細胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平升高（P＜0.05）；與miR-NC inhibitor組相比，miR-199a-5p inhibitor組PC12細胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平降低（P＜0.05）；與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組相比，miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho組PC12細 胞 中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平升高（P＜0.05）；miR-NC inhibitor組與OGD/R組、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組 與miR-199a-5p inhibitor組PC12細胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組PC12細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細胞介素-6（IL-6）水平/±s

表4 各組PC12細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細胞介素-6（IL-6）水平/±s

注：①與Control組比較，P＜0.05。②與OGD/R組比較，P＜0.05。③與miR-NC inhibitor組比較，P＜0.05。④與miR-199a-5p inhibitor組比較，P＜0.05。⑤與miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1組比較，P＜0.05。

組別Control OGD/R miR-NC inhibitor miR-199a-5p inhibitor miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1 miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho F值P值重復次數6 6 6 6 6 6 TNF-α/（μg/L）11.26±1.65 34.56±3.04①31.62±2.54①18.54±1.24①②③19.59±1.81①②③25.06±2.26①②③④⑤96.65＜0.001 IL-1β/（ng/L）105.36±10.22 354.36±21.19①322.66±17.55①187.63±14.32①②③202.58±15.33①②③260.57±18.63①②③④⑤186.03＜0.001 MCP-1/（ng/L）300.18±22.67 945.36±85.29①824.36±74.26①498.21±41.82①②③520.87±45.61①②③679.55±50.63①②③④⑤101.53＜0.001 IL-6/（ng/L）115.69±10.28 396.57±27.63①420.68±34.28①194.18±18.52①②③203.81±21.37①②③298.65±24.65①②③④⑤153.27＜0.001

2.5 miR-199a-5p與Klotho靶向驗證Targetscan預測發現，Klotho（簡稱KL）的3'-UTR區（1062-1069）存在與miR-199a-5p互補的結合位點。因此采用雙熒光素酶報告基因實驗進一步驗證，結果顯示，與miR-NC mimics組相比，miR-199a-5p mimics組轉染Klotho-WT的PC12細胞中相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而轉染Klotho-MUT的PC12細胞中相對熒光素酶活性變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 雙熒光素酶檢測Klotho與miR-199a-5p的靶向關系/±s

表5 雙熒光素酶檢測Klotho與miR-199a-5p的靶向關系/±s

注：①與miR-NC mimics組比較，P＜0.05。

組別miR-NC mimics miR-199a-5p mimics t值P值重復次數6 6相對熒光素酶活性Klotho-WT 1.02±0.05 0.41±0.04①23.34＜0.001 Klotho-MUT 1.06±0.04 0.98±0.05 3.06 0.012

3 討論

腦I/R損傷通常由手術麻醉、心臟驟停或中風引起，是世界范圍內導致死亡和殘疾的主要原因［9］。腦血流不足會導致腦損傷，血液再灌注會進一步加重腦損傷。I/R損傷導致興奮性神經遞質釋放、ROS生成過多、神經炎癥和神經元凋亡，這些過程是腦損傷的病理生理機制［10-11］。但目前尚無有效的I/R損傷治療策略。因此，尋找新的有效參與腦I/R損傷的分子靶點，有助于臨床制定有效的治療策略。

越來越多的證據表明，miRNA在神經系統疾病的發病機制中起著重要作用，包括腦I/R損傷。體內外研究表明，通過靶向miRNA抑制氧化應激和炎癥反應，對腦I/R損傷有良好的治療作用［12］。因此，基于miRNA的治療可能成為一種潛在且有前景的腦I/R損傷治療策略。近年來，miR-199a-5p因其在多種疾病中的作用而受到廣泛研究。已有報道稱，miR-199a-5p通過抑制癌細胞生長和誘導凋亡而抑制腫瘤生長［13］，miR-199a-5p還促進化療誘導不同類型的癌細胞凋亡［14］。另外，抑制miR-199a-5p提高了間充質干細胞的存活率［15］。這些發現表明miR-199a-5p是一個促進細胞凋亡的因子，因此，miR-199a-5p可能參與細胞凋亡相關的病理過程。令人關注的是，miR-199a-5p在心肌I/R中也起著重要的調節作用，抑制miR-199a-5p可促進心肌細胞對缺氧誘導的凋亡的耐受性［16］。另外，據報道，阿托伐他汀通過抑制miR-199a-5p保護心肌免受I/R損傷誘導的細胞凋亡［17］。這些結果表明，miR-199a-5p的下調對不良刺激的細胞具有保護作用。本研究結果表明，miR-199a-5p下調對神經元細胞PC12的OGD/R損傷有保護作用。有趣的是，有研究證實miR-199a-5p在神經系統疾病中起著關鍵作用。Wang等［18］報道，miR-199a-5p的下調減輕了毛果蕓香堿誘導的癲癇持續狀態，并通過抑制細胞凋亡來保護神經元免受損傷。此外，Li等［19］研究證實，抑制miR-199a-5p對OGD/R誘導的神經元凋亡和ROS的產生具有保護作用。本研究結果證實，miR-199a-5p下調可通過提高OGD/R誘導的PC12細胞活力，降低細胞凋亡，對神經元發揮保護作用。

氧化應激主要是由過量的ROS引起的，ROS廣泛參與包含細胞凋亡、神經損傷和炎癥等在內的多個病理過程，是腦I/R后神經元損傷的核心機制。而防御性抗氧化劑，如SOD和GSH-Px，可以改善氧化劑的升高，從而保護腦組織免受ROS細胞毒性［20］。miR-199a-5p已被證明可減少I/R損傷中的氧化應激反應和細胞凋亡［19］。同樣，本研究表明，miR-199a-5p抑制物改善了OGD/R誘導的PC12細胞中ROS生成和MDA含量（氧化應激引起的脂質過氧化的主要標志物）增加，并提高了SOD和GSH-Px活性。因此，這些結果表明，抑制miR-199a-5p可有效防止由ROS誘導的氧化損傷和脂質過氧化作用引起的I/R損傷。此外，研究表明，在I/R期間，促炎介質（TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6）水平顯著增高［21］。本研究 發 現，miR-199a-5p抑制物降低 了OGD/R誘導的PC12細胞中TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平。這些結果表明，miR-199a-5p抑制物可降低改善OGD/R誘導的PC12細胞炎癥反應。另外，令人感興趣的是，本研究證實，miR-199a-5p可靶向負調控Klotho的表達。多項研究表明，Klotho被鑒定為衰老抑制因子，其可影響許多對心血管疾病的發病機制及其預防至關重要的代謝途徑；同時，還具有抑制脂質過氧化和炎癥，并防止內皮損傷和血管鈣化的作用［22］。據報道，Klotho過表達可改善心肌梗死后氧化應激對心肌組織的損傷［23］。此外，Jin等［24］研究證實，腦卒中病人腦脊液中Klotho表達下調，上調Klotho表達可減輕氧化應激，從而改善腦I/R損傷后的認知功能障礙，進而對腦I/R損傷發揮保護作用。此外，本研究結果顯示，Klotho敲低逆轉了抑制miR-199a-5p對OGD/R誘導的PC12細胞的保護作用。以上研究結果說明，抑制miR-199a-5p可能通過上調Klotho對腦I/R損傷發揮保護作用。

總之，本研究結果表明，抑制miR-199a-5p對腦I/R損傷的保護可能是其在OGD/R誘導的PC12細胞中抗氧化和抗炎作用的結果，且Klotho有助于抑制miR-199a-5p表達對神經損傷的保護作用。這些結果可能為減輕腦I/R損傷提供新的策略，并為未來腦I/R損傷的研究提供幫助。然而，本研究尚存在一些局限性。目前尚不清楚miR-199a-5p直接靶向Klotho保護OGD/R誘導PC12細胞損傷的具體作用機制，這還需要進一步研究。此外，還需要在體內對腦I/R損傷模型進行研究，以進一步闡明miR-199a-5p對腦I/R損傷神經保護所涉及的具體機制。