前胡和硬前胡化學(xué)模式識別及檢驗方法研究

郭華靜，藺瑞麗，宋平順，郭曄紅

作者單位：1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000

前胡為常用中藥材，為傘形科植物白花前胡Peucedauum praeruptorum Dunn的干燥根［1］；產(chǎn)于河南、貴州、廣西、四川、湖北、湖南、江西、安徽、江蘇、浙江、福建等地。近年中藥材市場中發(fā)現(xiàn)前胡的混淆品種較多，前胡飲片檢驗的不合格率較高［2-3］，來自同科屬的華北前胡Peucedanum harry-smithii Fedd.ex Wolff；少毛北前胡Peucedanum harrysmithii Fedd.ex Wolff var.subglabrum（Shan et.Sheb）為其主要混淆品，商品習(xí)慣稱為“硬前胡”［4］，主產(chǎn)于甘肅、陜西等地。

由于前胡與硬前胡為同科屬植物，化學(xué)成分相近，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)目前對前胡質(zhì)量控制的研究，包括運用近紅外光譜對前胡進行真?zhèn)舞b別［5］和不同產(chǎn)地鑒別［6］，對前胡中歐前胡素、異歐前胡素等幾個呋喃香豆素成分的含量測定［7］，對前胡藥材HPLC指紋圖譜的研究［8-10］，這些都未能較全面表征前胡和硬前胡藥材之間的成分差異，所以前胡和硬前胡的區(qū)別有待研究。

市場流通的前胡來源比較復(fù)雜，前胡、硬前胡以及前胡中摻假硬前胡的判別研究鮮有報道。本研究采用HPLC法測定23批前胡、10批硬前和54批模擬樣品（前胡中摻假不同比例的硬前胡）中白花前胡甲素和乙素含量，通過對上述樣品中白花前胡甲素、白花前胡乙素的峰面積比值分析、相似度分析和聚類分析，建立判別前胡、硬前胡和摻假前胡的檢驗方法，可以快速識別前胡樣品中是否摻假和摻假多少比例的硬前胡，為前胡飲片的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器WATERS高效液相色譜儀（ACQUITY ARC）；WATERS-C18柱（250 mm×4.60mm，5μm）；KQ-300DB型超聲波清洗儀（昆山舒美儀器有限公司）；SECURA125-1CN型電子天平（德國SARTORIUS）；ELIX-ESSENTIAL-5純水儀；QNINTIX224-1CN型電子天平（德國SARTORIUS）。

1.2 材料白花前胡甲素（批號111711-201904），白花前胡乙素（批號111904-201804），購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（新藍景，色譜純）；甲醇（新藍景，色譜純）；水（屈臣氏）；無水甲醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純）；無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

23批前胡樣品為傘形科植物白花前胡Peucedauum praeruptorumDunn的干燥根；10批硬前胡樣品為傘形科植物華北前胡Peucedanum harrysmithiiFedd.ex Wolff、少毛北前胡Peucedanum harry-smithiiFedd.ex Wolff var.subglabrum（Shan et.Sheb）的干燥根；分別為2016年、2018年甘肅省藥品檢驗研究院存留樣品，拉丁學(xué)名經(jīng)由甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師鑒定。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件色譜柱：Waters SunFire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇溶液（A）-水溶液（B）梯度洗脫（0～15 min，75～85% A；15～18 min，85～75% A；18～22 min，75% A），流速：1.0 mL/min；PDA檢測器；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按白花前胡甲素峰計算不低于3 000。白花前胡甲素、白花前胡乙素對照品、前胡樣品、硬前胡樣品及摻假樣品溶液HPLC色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A為對照品；B為前胡樣品；C為硬前胡樣品；D為摻假樣品

1.3.2 溶液的制備

1.3.2.1 對照品溶液精密稱定白花前胡甲素、白花前胡乙素對照品各適量，用甲醇定容，分別得每1 mL含52 μg和75 μg的混合對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液取粉末（過三號篩），精密稱定1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲（300 W，40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.3 線性關(guān)系考察精密量取“1.3.2.1”項對照品溶液1，5，10，15，20 mL，分別定容于50 mL量瓶中，按“1.3.1”項下色譜條件測定，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，得回歸方程。白花前胡甲素：A=11 569C－1.455，r=0.999 2，質(zhì)量濃度在1.04～20.8 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。白花前胡乙素：A=11 951C－3 2l3，r=0.996 1，質(zhì)量濃度在1.58～30.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 精密度試驗取前胡（1號），按供試品制備方法制備，連續(xù)進樣6次，計算白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積的RSD分別為0.1%、0.1%，RSD均小于2.0%，表明該方法精密度良好。

1.3.4.2 重復(fù)性考察取前胡（1號），按供試品制備方法平行制備6份，按上述色譜條件進樣，計算白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積的RSD分別為1.46%、1.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.4.3 穩(wěn)定性考察取前胡（1號），按供試品制備方法制備，按“1.3.1”項下色譜條件，分別在0、6、16、24、32、48 h進樣，計算白花前胡甲素、白花前胡乙素峰面積的RSD分別為1.01%、0.71%，表明樣品48 h穩(wěn)定性良好。

1.3.4.4 加樣回收率試驗取前胡（1號）樣品6份，精密加入白花前胡甲素對照品（質(zhì)量濃度為4.20 mg/L）和白花前胡乙素對照品（質(zhì)量濃度為6.14 mg/L）適量，按供試品溶液制備方法制備并依法測定，計算回收率。結(jié)果白花前胡甲素平均回收率為97.61%，RSD為1.06%；白花前胡乙素平均回收率為98.54%，RSD為0.75%。

2 結(jié)果

2.1 樣品含量測定分別取23批前胡和10批硬前胡粉末各1.0 g，精密稱定，按“1.3.2.2”節(jié)下的方法進行處理，并按“1.3.1”節(jié)下的色譜條件進樣10 μL，各成分含量結(jié)果見表1。由表1可知前胡中白花前胡甲素、白花前胡乙素含量范圍分別為0.59%～1.64%、0.03%～0.41%，硬前胡中白花前胡甲素、白花前胡乙素含量范圍分別為0.00%～0.02%、0.17%～0.48%。

表1 33批樣品含量測定結(jié)果/%

2.2 前胡與硬前胡的識別方法分析

2.2.1 峰面積比值法發(fā)現(xiàn)在23批前胡樣品中，白花前胡乙素與白花前胡甲素的比值在0.09～0.91；10批硬前胡樣品中，白花前胡乙素與白花前胡甲素的比值在12.14～93.67。可見正品前胡中白花前胡乙素和白花前胡甲素的比值是小于1的，硬前胡中該比值大于1，通過峰面積比值法來區(qū)分前胡和硬前胡。見表2。

2.2.2 指紋圖譜相似度分析將上述色譜條件下檢測到的所有前胡樣品數(shù)據(jù)結(jié)果以AIA的格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），選定S1號樣品為參照色譜圖，23份前胡樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.848～0.998，10份硬前胡樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.103～0.169，表明硬前胡樣品與前胡樣品差異性較大，可以采用相似度判斷真?zhèn)巍＝Y(jié)果見表2。

表2 33批樣品峰面積比值/相似度數(shù)據(jù)

2.2.3 聚類分析以2種化學(xué)成分的含量為變量，運用SPSS 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對其進行系統(tǒng)聚類分析，利用平方歐式距離作為樣品的測度，采用組內(nèi)聯(lián)接法進行聚類，結(jié)果顯示，歐式距離為25時分為兩類，前胡聚一類，硬前胡為一類。而在前胡中又以質(zhì)量的相近程度而進一步相聚，此結(jié)論和相似度分析一致。

2.3 前胡中摻假硬前胡的比值考察在正品前胡（1～4號）中分別摻入3%～50%不同比例的硬前胡（24～33號），共計54批樣品，測定白花前胡乙素/白花前胡甲素峰面積比值，見表3。

表3 4批前胡與6批硬前胡不同比例的樣品峰面積比值與相似度/%

可見，在4批正品前胡摻假6批硬前胡后，比值在0.14～0.97，摻假在17%之下相似度在0.8之上，23批正品前胡中比值在0.09～0.91；由于前胡和硬前胡來自不同的產(chǎn)地，所含白花前胡乙素/白花前胡甲素本身差異較大，因此，前胡與摻假硬前胡的比值存在重疊部分，約65%的正品前胡的比值小于0.20，約78%的摻假前胡的比值大于0.20，顯示一定的同質(zhì)性，留后進一步研究。但是對于前胡與硬前胡，采用比值法完全可以進行區(qū)分。

3 討論與結(jié)論

3.1 試驗條件的優(yōu)化

3.1.1 供試品提取方法考察參考文獻和《中國藥典》中的方法，選擇了三氯甲烷、不同比例的甲醇和乙醇進行試驗，發(fā)現(xiàn)使用純甲醇進行提取時，色譜峰信號較多，且各成分的提取量較多，故選擇純甲醇作為提取溶劑。

3.1.2 供試品提取時間考察在相同的提取溶劑下，隨著超聲時間的增加，各成分的提取量增多，但實際增加的量較小，根據(jù)結(jié)果選擇超聲處理30 min。

3.1.3 檢測波長的選擇比較前胡、硬前胡、硬前胡摻假樣品不同波長色譜圖發(fā)現(xiàn)，320 nm時藥材的色譜峰信息最全、基線最好、各特征峰的紫外吸收較強。故選擇320 nm的波長為該方法檢測波長。

3.2 前胡與硬前胡及摻假的識別對前胡、硬前胡和前胡中摻假不同比例硬前胡，進行白花前胡乙素/白花前胡甲素峰面積比值、相似度分析和聚類分析，結(jié)果三種分析方法都可以將前胡與硬前胡完全區(qū)分；而前胡和前胡中摻假不同比例硬前胡峰面積比值存在重疊情況，未能完全識別。

3.3 檢驗方法本實驗建立的HPLC色譜方法，采用峰面積比值、相似度分析和聚類分析均可前胡與硬前胡的識別。作為標(biāo)準(zhǔn)，建議規(guī)定白花前胡乙素/白花前胡甲素峰面積比值1.0為區(qū)分前胡與硬前胡的判別條件，小于1.0為前胡，大于1.0為硬前胡。

3.4 結(jié)論經(jīng)過對前胡、硬前胡和模擬摻假樣品的研究，通過白花前胡乙素/白花前胡甲素的峰面積比值、聚類和特征圖譜相似度等分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所建立的方法能夠準(zhǔn)確、有效檢驗前胡和硬前胡，并且這些方法具有簡單、快速、高效的功能。