高效液相色譜法測定獸藥伊維菌素注射液含量的不確定度評定

陳錫龍，趙 貴,楊 強，周澤曉，孫真崢，王慶紅，謝麗麗

(貴州省獸藥飼料檢測所，貴陽 550003)

伊維菌素(Ivermectin，IVM) 是大環內酯類抗寄生蟲藥，用途極為廣泛。國內臨床上常用于治療牛、羊、駱駝、豬等多種家畜的寄生蟲病，也被用于治療魚類中華鳋、錨頭鳋、車輪蟲感染等疾病[1-4]。一些非洲國家則使用伊維菌素來治療人的瘧疾、疥瘡以及傳染性寄生蟲病[5-7]。新冠肺炎暴發后，伊維菌素還被用于預防和治療新冠病毒[8-9]。獸藥伊維菌素注射液被收載于《中華人民共和國獸藥典》一部中，目前，關于伊維菌素含量測定不確定度的評定鮮有報道。而測量不確定度評定是日常檢驗工作的重要組成部分，可為進一步提高檢測數據的質量提供技術支撐，對實驗室管理和質量控制具有重要意義。本實驗參考JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS-GL006-2019 《化學分析中不確定度的評估指南》的要求，采用標準曲線定量，對高效液相色譜法測定伊維菌素注射液含量實驗過程中的不確定度來源進行分析評估，以期為實驗室科學、準確測量伊維菌素注射液的含量提供質量控制依據。

1 材料和方法

1.1 儀器設備 Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色譜儀配DAD檢測器(美國賽默飛公司)；BP211D型電子分析天平(感量：0.01 mg，德國塞多利斯公司)；電子分析天平(感量：0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Direct-Q8UV-R去離子水發生器(美國Millipore公司)。

1.2 材料和試劑 伊維菌素對照品(批號：K0192007，含量92.0%，中國獸醫藥品監察所)；伊維菌素注射液(貴州省獸藥飼料檢測所監督抽檢樣品，由C公司生產，批號：20200301；規格：按伊維菌素(H2B1a+H2B1b)計算5 mL:50 mg)；甲醇為色譜純(德國Merck公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm，4.6×250 mm)；柱溫為30 ℃；流動相：水-甲醇-乙腈(12∶35∶53)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣體積為20 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取伊維菌素對照品54.24 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，即得伊維菌素為0.9980 mg/mL對照品貯備液。精密量取伊維菌素對照品貯備液1.00、2.00、3.00、5.00、10.00和25.00 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得伊維菌素濃度為0.03992、0.07984、0.11976、0.1996、0.3992和0.9980 mg/mL的標準工作曲線系列溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 精密吸取伊維菌素注射液樣品5.00 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻。另取上述稀釋液5.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得。

1.3.4 數學模型和不確定度來源分析 本實驗的數學模型為：

根據數學模型，可知不確定度來源主要包括：對照品溶液配制引入的不確定度；標準工作曲線擬合引入的不確定度；樣品前處理引入的不確定度；樣品重復測量f重復測量引入的不確定度。

2 結果與分析

2.1 對照品溶液配制引入的不確定度

2.1.1 對照品貯備液配制濃度c0引入的不確定度

1.578×10-3mg

3.156×10-5

稱取對照品質量合成標準不確定度u(m0)的計算：

由于稱取對照品質量需要通過兩步操作才能完成，即回零和稱樣，故：

2.1.1.4 對照品含量引入的不確定度urel(ρ) 根據標準物質證書提供的信息，對照品伊維菌素(H2B1a+H2B1b)的含量為92.0%。使用前無需干燥。開封后一次使用。包裝及裝量：棕色安瓿裝，每支約100 mg；貯存條件：嚴封，避光，5 ℃以下保存。測定時使用的對照品為新購入且按貯存條件保存的未開封對照品，未給出不確定度量值，故不考慮含量引入的不確定度。

2.1.2 配制標準工作曲線系列溶液引入的不確定度 配制標準工作曲線系列溶液引入的不確定度包括對照品貯備液量取、稀釋定容引入的不確定度。其中稀釋定容(共5次)，即分別用適當的單標線吸量管量取相應體積的對照品貯備液置25 mL量瓶中，然后稀釋定容得到std1～std5共5個標準曲線系列溶液，std6實際上只是轉移，不涉及定容，此處不會引入不確定度。

表1 不同規格單標線吸量管吸取對照品貯備液引入的不確定度Tab 1 Uncertainty from preparation of working standard solutions with different pipette

4.02×10-3mL。

表2 標準曲線擬合引入的不確定度Tab 2 Uncertainty from working curve fitting

2.3 樣品前處理引入的不確定度 樣品前處理引入的不確定度包括樣品取量、稀釋定容及溫度變化引起的液體體積膨脹引入的不確定度。樣品的處理：取15支同一批號的伊維菌素注射液倒入一清潔小燒杯中，混勻，用5 mL單標線吸量管吸取5.00 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，混勻；另取上述稀釋液5.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，混勻，即得。

2.3.1 樣品前處理引入的不確定度分量分析 樣品前處理引入的不確定度包括第一次吸取伊維菌素注射液并定容及第二次吸取稀釋液并定容引入的不確定度。

2.4 樣品測量重復性引入的不確定度 在重復性條件下，對伊維菌素注射液分別取樣測量10次，每次進樣3針。測量結果見表3。

表3 樣品測量重復性引入的不確定度結果Tab 3 Uncertainty of samples measuring repeatability

2.5 合成相對標準不確定度及擴展相對標準不確定度

2.5.2 擴展相對標準不確定度 取置信水平p=95%，k=2。則擴展相對標準不確定度Urel=2×1.46×10-2=2.92×10-2。

2.6 主要不確定度來源及相對貢獻 主要不確定度來源及相對貢獻統計結果見表4。

表4 主要不確定度來源及相對貢獻Tab 4 Components of relative standard uncertainty

由表中可以看出，不確定度主要來源于標準工作曲線系列溶液的配制、樣品前處理及對照品貯備液配制環節。

3 結論與討論

本研究依據《中華人民共和國獸藥典》2020年版一部獸藥伊維菌素注射液含量測定的高效液相色譜法，采用標準曲線定量，對高效液相色譜法測定伊維菌素注射液含量的實驗過程中的不確定度來源進行分析評定。參考不確定度評估相關要求，構建不確定度評估模型，分析了不確定度的來源，并對其進行評定，計算了各分量的相對不確定度，同時給出擴展相對不確定度。通過分析不確定度的相對貢獻可知，不確定度主要來源于標準工作曲線系列溶液的配制、樣品前處理及對照品貯備液配制環節，測量過程中應重點關注并嚴格控制檢測風險。