22味中藥及其復方對奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗研究

葉建新，陳星宇，張成宇，趙 雙，李昭龍，王冠男，程曉薇，于忠娜，于 雷

(青島農業大學海都學院，山東萊陽 265200)

奶牛乳房炎是危害全世界奶牛的主要疾病之一[1]，也是影響奶牛健康和乳制品安全的關鍵因素[2]。乳房內細菌性感染被認為是奶牛乳房炎的主要原因。其中，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要傳染性病原體之一[3]，也是一種常見的食源性致病微生物。奶牛感染金黃色葡萄球菌引發的乳房炎通常是慢性感染[4]，雖然不會導致奶牛的異常或死亡，但由該菌產生的降解酶和毒素會不可逆地損害乳房組織[5]，最終降低產奶量。目前，應用抗生素仍是奶牛乳房炎的主要治療策略[6]。但使用抗生素治療由金黃色葡萄球菌引發的感染，會使該菌產生生物膜并適應宿主環境[7-8]，產生耐藥性[9]，從而增加治療難度。此外抗生素會在奶牛體內產生不同程度的藥物殘留，這不僅制約了我國畜牧業的健康發展，也將危害人們的日常飲食健康[10]。

我國中草藥資源豐富，且中草藥具有毒副作用小、藥物殘留少等優點，且中草藥的活性物質具有抗菌、消炎和免疫調節等作用。使用中草藥代替抗生素在如今的無抗時代是大勢所趨，可以從根本上提高牛奶品質，提高畜牧業的經濟效益[11]。試驗選取并研究了22味中草藥及其復方對金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，為進一步研發防治金黃色葡萄球菌引起的乳房炎中草藥制劑及實際臨床應用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 金黃色葡萄球菌，分離自山東省煙臺市某奶牛場患乳房炎奶樣，由青島農業大學食品科學與工程學院微生物實驗室鑒定、保存并贈送。

1.2 試驗藥物 黃芩、鉤藤、王不留行、菊花、神曲、紅花、白頭翁、金銀花、獨活、大黃、山藥、桃仁、黃柏、丹皮、藿香、甘草、柴胡、白術、黃芪、蒲公英、地榆、厚樸共22味中藥，均購自于山東省萊陽市棗行藥店。

1.3 試劑和儀器 LB培養基，購自青島海博生物技術有限公司；恒溫培養箱(WJ-3-160),購自上海躍進醫療器械廠；超凈工作臺(SW-CJ-2FD),購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；恒溫搖床(SHAKE SCS-24)，購自上海市離心機械研究所有限公司；常規儀器與試劑,均由青島農業大學海都學院預防獸醫學實驗室提供。

1.4 菌液活化及濃度的測定 金黃色葡萄球菌的分離活化，參考文獻[12]的方法進行，將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養基，37 ℃培養24 h；挑取單個菌落接種至5 mL液體培養基，37 ℃、200 r·min-1搖床培養16 h。每隔2 h用分光光度計在600 nm測定OD值，確定細菌的對數期，參考文獻[13]的方法，利用平板計數法測定菌落數，調整菌液的濃度為2x109CFU·mL-1。

1.5 中藥的制備 稱取各中藥20 g置于燒杯中加入300 mL蒸餾水，浸泡1 h后，倒入鍋中武火加熱至沸騰，隨后文火加熱50 min。加熱后用8層紗布過濾，取出藥渣，再加入300 mL蒸餾水，倒入鍋中，步驟同上。合并兩次濾液，加熱濃縮至1 g·mL-1，室溫放置12 h，6 000 r·min-1離心5 min，取上清液，高壓滅菌，在4 ℃冰箱中保存。

1.6 藥敏片的處理 參考文獻[14]的方法，取22味中藥提取液各1 mL于1.5 mL離心管中，分別放入10片藥敏片，充分浸泡24 h后，轉移至玻璃平皿中并將藥敏片不重疊的擺平分開。放入37 ℃恒溫箱烘干24 h后做好標記，放入4 ℃冰箱備用。

1.7 中藥抑菌試驗及復方的抑菌試驗

1.7.1 單味中藥的抑菌試驗 取20 μL稀釋后的菌液(2x108CFU·mL-1)于培養皿中，用涂布棒均勻涂布，用鑷子在酒精燈火焰上消毒后，夾取處理過的藥敏片放入培養皿中，按平按實，并在平板底部做好標記。用封口膜對培養皿進行封口處理，倒置平板，放入恒溫箱37 ℃培養24 h。每種藥物3個重復，取平均值。參照文獻[15]的測定標準：抑菌圈大于15 mm時判定為高敏，介于10～15 mm時判定為中敏；小于10 mm時判定為低敏。

1.7.2 中藥復方的篩選及抑菌試驗 把地榆、黃芩、白術、丹皮提取液按2∶2∶2∶1、4∶4∶4∶1、2∶2∶1∶2、4∶4∶1∶4、2∶1∶2∶2、4∶1∶4∶4、1∶2∶2∶2、1∶4∶4∶4的比例配伍，制備復方中藥的水提液，并依次命名為復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ，各復方藥物濃度均為1 g·mL-1，6000 r·min-1離心5 min，過濾后高壓滅菌，置于4 ℃保存。中藥復方的藥敏片處理與1.5相同；復方中藥的抑菌試驗與1.6.1相同。

1.7.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 參照文獻[16]在1～7號管和9號管各加入0.1 mL稀釋好的菌液(2x108CFU·mL-1)，37 ℃恒溫培養24 h，具體步驟見表1，24 h后將制備好的菌液涂布于培養基上，置于37 ℃恒溫箱18 h，以菌落分散生長的視為有抑菌效果，此時最低藥物濃度值為其MIC值;以肉眼觀察無菌落生長的為100 %被殺滅，此時最低藥物濃度值為MBC。

表1 二倍稀釋法Tab 1 Double dilution method

2 結果與分析

2.1 單味中藥抑菌試驗結果 由表2可見，22味中藥中篩選出對奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌有抑菌作用的有13種，其中黃芩和地榆的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑分別為18.30±1.02 mm和18.32±1.00 mm，均屬于高度敏感；黃柏、丹皮、甘草、白術、獨活共5味中藥均屬中度敏感，抑菌圈直徑分別為11.88±0.36 mm、13.34±0.56 mm、10.60±0.26 mm、14.48±0.66 mm和11.30±0.58 mm；藿香、柴胡、黃芪、蒲公英、菊花、金銀花共6味中藥屬低度敏感；其余9種無抑菌效果。

表2 單味中藥抑菌結果(mm)Tab 2 Antibacterial test results of single traditional Chinese medicine(mm)

2.2 復方中藥抑菌試驗結果 由表3可見，所有復方對奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌均表現出一定的抑菌效果，且均為高度敏感。

表3 復方中藥抑菌試驗結果(mm)Tab 3 Antibacterial test results of compound traditional Chinese medicine(mm)

2.3 單味中藥MIC和MBC測定結果 22味中藥中，地榆的MIC值為31.25 mg·mL-1，MBC值為31.25 mg·mL-1，抑菌和殺菌效果較其他單味中藥強，其次是黃芩和白術。具體數據見表4。

表4 單味中藥MIC和MBC測定結果(mg·mL-1)Tab 4 Determination results of MIC and MBC of single traditional Chinese medicine(mg·mL-1)

2.4 中藥復方MIC和MBC測定結果 八種中藥復方制劑中復方Ⅱ和復方Ⅶ的抗菌和殺菌能力較強，其MIC和MBC均為31.25 mg·mL-1；其余中藥復方也有一定抑菌效果。具體數據見表6。

表5 中藥復方MIC和MBC測定結果(mg·mL-1)Tab 5 Determination results of MIC and MBC of traditional Chinese medicine compound(mg·mL-1)

3 討論與結論

研究發現單味中藥中黃芩和地榆水提液對金黃色葡萄球菌體外抑菌呈高度敏感，左國營等人[17]的結果也顯示地榆、黃芩兩種藥物對金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。研究證實，黃芩的主要抑菌成分是黃芩苷和黃芩素，其中黃芩素能夠抑制細菌形成生物保護膜，削弱細菌的自我保護能力，并通過干擾細菌蛋白質合成和抑制三羧酸循環達到抑菌作用，黃芩不僅作為單味藥發揮抑菌作用明顯，與其它中藥配伍時還能起到良好的協同作用[18]。鞣質、酚酸類、皂苷類及黃酮類成分是地榆發揮其抑菌效果的主要活性成分[19]。地榆可能是通過提高金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性，破壞細菌整體的穩定性和完整性，利于鞣質等抑菌成分進入細菌內部，從而發揮抑菌作用。本試驗中白術、丹皮對金黃色葡萄球菌也具有較好的抑菌效果，這與前人[20-21]的研究結果一致。白術主要是通過揮發性油和多糖類成分進行抑菌，白術揮發油對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和草綠色鏈球菌的抑菌作用明顯[22]。本試驗采用水煎法熬制中藥，無法獲得白術揮發油，證實白術水提液對金黃色葡萄球菌也具有較好的抑菌作用，但其抑菌機制有待進一步研究。

試驗采用二煎法水煎的方式熬制提取中藥，但是各類中藥性狀、結構不同，僅用傳統水煎方法提取出的中藥有效成分有所差異，水溶性成分并不是所有中藥的有效抑菌成分，采取水煎法所提取的藥液并不能完全發揮出所選取中藥的真正抑菌效果，可能得到的水提藥液中僅是一般化學成分，或是活性成分的前體成分，其對試驗結果存在不同程度的影響。本試驗中所得的中藥抑菌圈直徑與相關文獻[23-25]有一定差異，可能是菌株的來源不同、中藥的提取方法不同、抑菌試驗采用的方法不同而造成結果上的差異。此外，本研究中單味中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌效果測定結果多為低敏或不敏感，可能是單味中藥藥敏試驗中所選的濃度過低所致，還需要調整藥液濃度進一步研究，篩選出對病原菌有抑菌效果的藥液濃度。

研究發現復方藥的抑菌效果普遍強于單味藥，可能是所選中藥之間發揮協同抑菌作用；但復方藥中也存在抑菌效果弱于單味藥，可能是復方藥中僅單味中藥發揮抑菌作用或某幾種中藥出現拮抗抑菌作用。各類中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌機制各不相同，從而產生的抑菌效果也存在差異。因此挑選合適的，具有高效抑菌的中藥具有非常重要的臨床價值。而通過組合、配伍將不同的單味藥形成副作用小、抑菌效果好的復方中藥仍然需要不懈的深入研究，在當今國家嚴格管控抗生素使用的背景下，本試驗為臨床上研究防治奶牛乳房炎致病菌中金黃色葡萄球菌的中藥復方提供參考。由于中藥種類較多，有效成分復雜，其復方的配比和復方之間抑菌作用的相互影響還有待進一步研究。