湖南省奶牛源金黃色葡萄球菌分離鑒定與耐藥性分析

周汝順，寧柯銘，江 燕，肖安東，劉曙光*

(1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，長沙 410006；2.湖南農(nóng)業(yè)大學，長沙 410128)

奶牛乳房炎是近年來危害奶業(yè)發(fā)展的重要疾病，而金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)被證明是引起奶牛乳房炎最常見的病原菌之一，主要通過定植、黏附于家畜的乳腺上皮細胞，導致母牛乳腺膿腫、硬化或瘺管[1-2]；病畜可見明顯的乳房發(fā)熱、發(fā)硬、疼痛，產(chǎn)出微紅至黑色的帶有惡臭絮狀物的乳汁，嚴重時可能危害到病畜生命；或是影響牛奶品質(zhì)，造成食物中毒，嚴重危害食品安全和公共衛(wèi)生安全。目前，對于金黃色葡萄球菌引起的感染主要通過抗菌藥物進行治療，然而，隨著抗菌藥物的大量使用，金黃色葡萄球菌通過自身表型及代謝通路的改變對抗菌藥物逐漸產(chǎn)生適應性耐藥，同時還可以通過水平轉移獲得耐藥基因，從而對各種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥，導致多重耐藥菌株出現(xiàn)，并快速傳播[3]。尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)自發(fā)現(xiàn)以來感染幾乎遍布全球，MRSA除了對新型半合成β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有耐藥性之外，還能抵抗大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類及喹諾酮類等多種抗菌藥物的作用，是名副其實的“超級細菌”[4-5]。近年來，苯唑西林敏感-mecA基因陽性的金黃色葡萄球菌 (Oxacillin-sensitivemecA-positive,OS-MRSA)在人醫(yī)臨床及動物性食品檢測中頻頻被報道[6]，廣泛引起人們的關注，所以僅憑耐藥表型判斷MRSA具有一定局限性，需結合mecA基因檢出情況來區(qū)別OS-MRSA和苯唑西林耐受-mecA陽性金黃色葡萄球菌(Oxacillin-resistantmecA-positive,OR-MRSA)。為了解湖南省奶牛源金黃色葡萄球菌的耐藥情況，本試驗選用18種獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物進行耐藥性檢測并對數(shù)據(jù)進行分析，以期為臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)支撐和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC29213)來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 樣品來源 257份牛乳樣品于2020-2021年采集自湖南長沙、常德、邵陽、永州、郴州等地奶牛養(yǎng)殖場。

1.1.3 主要試劑與培養(yǎng)基 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自北京路橋技術股份有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；Vitek 2 GP細菌鑒定卡購自法國梅里埃公司；革蘭氏陽性菌藥敏檢測板購自天津金章科技發(fā)展有限公司；BTS標準品溶液、HCCA質(zhì)譜基質(zhì)溶液購自德國BRUKER公司；Biospin 細菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司;T3 Super PCR Mix購自北京擎科生物科技有限公司。

1.1.4 儀器 基質(zhì)輔助激光電離飛行時間質(zhì)譜儀(Miccroflex LH/SH，德國BRUKER公司)；全自動生化鑒定儀(VITEK 2 Compact，法國梅里埃公司)；濁度計(VITEK 2，法國梅里埃公司)；PCR擴增儀(T100，Bio-Rad公司)；光學顯微鏡(BX51，日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 預增菌 吸取1 mL牛乳樣品加入10 mL 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯中，36 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分離 將上述增菌后的液體培養(yǎng)物，劃線接種至金黃色葡萄球菌顯色平板上，于36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取可疑菌落，接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，于36 ℃培養(yǎng)22 h，待進一步細菌鑒定。

1.2.3 細菌鑒定

1.2.3.1 質(zhì)譜鑒定 取營養(yǎng)瓊脂平板上的純化菌，均勻涂布于靶板樣品孔中，加70%甲酸溶液1 μL，晾干后加HCCA質(zhì)譜基質(zhì)溶液1 μL，混勻，晾干。同時用1 μL BTS標準溶液作為對照，同法處理。將樣品靶板放入 質(zhì)譜儀，采集數(shù)據(jù)并處理。

1.2.3.2 生化鑒定

1.2.3.2.1 形態(tài)學鑒定 將分離純化的疑似菌株進行革蘭氏染色后鏡檢,觀察菌落形態(tài)。

1.2.3.2.2 觸酶反應 取營養(yǎng)瓊脂上的新鮮菌株培養(yǎng)物，置潔凈載玻片上，滴加0.3%過氧化氫溶液1滴，觀察。

1.2.3.2.3 全自動生化鑒定儀鑒定 將鏡檢和觸酶反應陽性的疑似菌株，挑取新鮮菌落至無菌生理鹽水中，調(diào)菌液濃度至0.5個麥氏單位，將GP細菌鑒定卡懸浮管插入菌懸液，按照VITEK 2 Compact鑒定儀操作上機處理。

1.2.4 藥敏檢測 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)方法，采用肉湯稀釋法對分離菌株進行藥物敏感性試驗，檢測其對青霉素等18種臨床上常見抗菌藥物的耐藥性。

挑取新鮮菌落于適量無菌水中，用濁度計調(diào)菌懸液濃度至 0.5個麥氏單位，吸取 120 μL 菌懸液加入24 mL 肉湯，混勻，吸取100 μL肉湯菌懸液接種于含倍比稀釋藥物的革蘭氏陽性菌藥敏檢測板中，空白對照孔中加入 100 μL 無菌肉湯，36 ℃培養(yǎng)18 h。用質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(ATCC29213)同法操作驗證藥敏檢測板的質(zhì)量。

1.2.5 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的鑒定

1.2.5.1 引物設計與合成 參照吳博威[7]提供的引物擴增mecA基因。引物由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成，上游引物:5′-CACCTTGTCCGTAACCTGAA-3′；下游引物：5′-TGGCTCAGGTACTGCTATCC-3′；目的片段大小約為533 bp。

1.2.5.2 DNA提取及擴增 將藥敏試驗篩選出對頭孢西丁和苯唑西林均耐藥的菌株，按照Biospin 細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。PCR反應體系25 μL：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，T3 Super PCR Mix 22 μL。反應程序如下：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸12 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 細菌分離 從257份牛乳樣品中分離鑒定金黃色葡萄球菌39株，分離率為15.18%。

2.2 細菌鑒定結果

2.2.1 質(zhì)譜鑒定 用BTS標準品作為質(zhì)控樣品對質(zhì)譜儀進行自動校準，將采集的待測樣品數(shù)據(jù)圖譜與數(shù)據(jù)庫中已知菌株的數(shù)據(jù)圖譜比對，得到相似度數(shù)值，達到種水平可信值即可判定(判定分值大于2.0)。質(zhì)譜鑒定結果顯示，分離到的39株菌株均為金黃色葡萄球菌，部分結果見表1。

2.2.2 生化鑒定確認

2.2.2.1 形態(tài)學鑒定 39株疑似菌株經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，全部為革蘭氏陽性、呈葡萄狀排列的球菌(圖1)。

2.2.2.2 觸酶反應 滴加0.3%過氧化氫溶液后立即產(chǎn)生氣泡者即為觸酶試驗陽性，39株疑似菌株觸酶反應全部顯示為陽性(圖2)。

2.2.2.3 細菌生化鑒定 VITEK 2 Compact鑒定儀根據(jù)所分析的細菌和Vitek 2 GP細菌鑒定卡43個生化反應的數(shù)據(jù)和知識等方法鑒定細菌。良好匹配的生化反應和每個微生物的獨特生化反應，良好匹配的可能性百分比99%。生化鑒定試驗結果顯示，分離到的39株菌株均為金黃色葡萄球菌(可信限范圍均大于95%)，鑒定結果與微生物質(zhì)譜鑒定的結果完全一致(部分生化鑒定結果見表2)。

2.3 藥敏檢測結果 根據(jù)藥敏檢測板說明書讀取各抗菌藥物MIC值，結合 CLSI 規(guī)定的MIC折點來判斷分離菌株是否耐藥。藥敏結果顯示，39株分離菌株對青霉素耐藥率最高，為82.05%，對紅霉素耐藥率為33.33%，對克林霉素、替米考星、慶大霉素、頭孢西丁耐藥率在20%～30%之間；對于苯唑西林、氟苯尼考耐藥率在10%～20%之間；對多西環(huán)素及萬古霉素絕對敏感，耐藥率為0(圖3)。

表1 部分分離菌株質(zhì)譜鑒定結果Tab 1 Results of mass spectrometry identification of some isolated strains

圖1 革蘭氏染色鏡檢圖(1000×)Fig 1 Gram staining microscopic examination (1000×)

1 ：陽性對照；2：陰性對照；3：分離菌株1：positive control; 2:negative control; 3:Isolated strains圖2 觸酶試驗結果Fig 2 Results of thiase test

表2 部分分離菌株生化鑒定結果Tab 2 Biochemical identification results of some isolated strains

圖3 分離菌株對18種抗菌藥物耐藥率圖Fig 3 The drug resistance rate of isolated strains to 18 kinds of antibacterial drugs

按照抗菌藥物分類，39株分離菌株對β-內(nèi)酰胺類(青霉素、奧格門丁、苯唑西林)抗菌藥物耐藥率達82.05%；對大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、替米考星)抗菌藥物耐藥率達35.89%；對磺胺類(磺胺異噁唑、復方新諾明)及喹諾酮類(恩諾沙星、氧氟沙星)藥物耐藥率均為7.69%，詳見圖4。

圖4 分離菌株對不同類別抗菌藥物的耐藥率比較圖Fig 4 Comparison of drug resistamce rates isolates to different kinds of antibiotics

多重耐藥情況復雜，耐藥譜廣。發(fā)現(xiàn)有35株分離菌株表現(xiàn)為不同程度的耐藥，有17種不同的耐藥譜(表3)。最常見的耐藥譜為PEN，有15株，占菌株總數(shù)的41.03%。多重耐藥(三重耐藥及以上)菌株比例達38.46%，最多為9重耐藥，其中以7重耐藥菌株數(shù)最多，耐藥譜為PEN-CFX-CLI-ERY-OXA-TIL-GEN，占7.69%；多重耐藥主要集中在7～8重和3～4重耐藥。4株分離菌株對全部18種抗菌藥物均不耐藥。

2.4 MRSA的鑒定情況 瓊脂糖凝膠電泳結果在533 bp有條帶，即為檢測出mecA基因，判定為MRSA。39株分離菌株中有19株mecA基因檢測為陽性，判定為MRSA(圖5)，MRSA檢出率為48.72%；

1～5.部分分離菌株mecA基因條帶；6.陰性對照；M.Maerker1～5.Parts of strains mecA gene bands;6.Negative control;M.Maerker圖5 mecA基因檢測電泳圖Fig 5 Electrophoretogram of identification of mecA gene

表3 分離菌株耐藥譜統(tǒng)計表Tab 3 Statistical table of drug resistance spectrum of isolated strains

結合藥敏試驗結果，對苯唑西林耐藥的7株菌株中有4株檢出mecA基因，即為OR-MRSA菌株，另15株則為OS-MRSA菌株。

3 討 論

本試驗中細菌鑒定先用質(zhì)譜儀初步鑒定，再用全自動生化鑒定儀進行確認。質(zhì)譜鑒定是基于微生物特征蛋白指紋圖譜進行鑒定，而全自動生化鑒定儀則是利用鑒別性的生化試驗鑒定細菌的典型反應。二者鑒別原理不同，本試驗用兩種不同的鑒定方法是為了提高細菌鑒定的準確率。

根據(jù)藥敏檢測結果來看，湖南地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率達82.05%，且全部對青霉素耐藥；對紅霉素耐藥率為33.33%，這與寧夏地區(qū)[8]相關研究結果基本一致，但與我國其他奶牛養(yǎng)殖省份相關研究結果存在差異[9-12],尤其是對紅霉素、磺胺類、四環(huán)素類藥物耐藥率相差較大。總的來說，近年來我國奶牛源金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素耐藥率普遍較高，且不同省份之間或是同一個省份不同地區(qū)耐藥性差異顯著，說明金黃色葡萄球菌耐藥性具有地域性[13]，可能與各養(yǎng)殖場本身的用藥習慣有關。尤其是在湖南地區(qū)，養(yǎng)殖場用藥以青霉素為主，獲得性耐藥比例高。

本次分離的39株菌株中有4株對檢測的所有抗菌藥物不表現(xiàn)耐藥，推測可能是養(yǎng)殖場減抗或替抗成效明顯，亦或是耐藥基因表達沉默的結果[14]，需結合其他耐藥基因檢出情況進行判斷。

一直以來，苯唑西林和頭孢西丁耐藥表型檢測被認為是判斷MRSA的標準，然而近些年來，隨著養(yǎng)殖行業(yè)抗菌藥物使用種類和方式的改變，動物源性細菌對于抗菌藥物的敏感性也在發(fā)生變化，已有部分MRSA 菌株表現(xiàn)對苯唑西林敏感[15]，即OS-MRSA。OS-MRSA的存在可能造成對MRSA的誤判，從而在抗菌藥選擇中引發(fā)超耐藥 MRSA 變異菌株的出現(xiàn)[16]；本次研究中，OS-MRSA的比例占全部MRSA的78.95%，說明我省奶牛源MRSA對苯唑西林表現(xiàn)敏感的比例較高，應加強對我省奶牛源性OS-MRSA的監(jiān)測。另外，有3株分離株表現(xiàn)為對苯唑西林耐藥，卻未檢測到mecA基因，推測可能是藥敏試驗讀數(shù)存在誤判，或與femB基因的協(xié)同作用有關[17]，需對femB基因進行進一步檢測。

通過對2020-2021年奶牛源金黃色葡萄球菌耐藥性監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)有近90%分離菌株表現(xiàn)為不同程度的耐藥，為避免多重耐藥菌株的出現(xiàn)，應規(guī)范奶牛養(yǎng)殖業(yè)中抗菌藥的使用，在合理劑量范圍內(nèi)盡量選用敏感性高的藥物且輪換使用藥物，并且積極開發(fā)、使用抗菌藥替代品，如中草藥、噬菌體和抗菌肽等。此外，加強奶牛的飼養(yǎng)管理，做好養(yǎng)殖欄舍的清潔與消毒工作，規(guī)范擠奶操作也是預防奶牛乳房炎的重要舉措。