石油烴降解菌Mycolicibacterium fluoranthenivorans Y3的篩選鑒定及降解特性研究

郭 巖，馬 建，楊宗政，張天宇，孫 煒，吳志國

（1.天津津港基礎設施養護運營工程管理有限公司，天津 300456；2.天津科技大學海洋與環境學院，天津 300457；3.天津科技大學化工與材料學院，天津 300457）

0 引言

石油作為運輸業重要的動力燃料，其產量與需求量逐年提高。石油生產、儲存及使用等過程中難免會泄露于外界環境中[1]，因其具有成分復雜、難降解等特點，長期滯留于環境中會導致嚴重的水、土環境污染[2,3]。石油中包含多種不同的正構、異構烷烴、多環芳烴等[4-5]，在眾多石油烴污染的修復方法中，生物修復法是清除環境中石油烴污染物最經濟、有效的方法，能夠通過微生物的特異性代謝作用將石油烴轉化成無毒的終產物[6-8]。具有石油烴降解能力的菌株種類繁多，但其中有關分枝桿菌屬的報道相對較少，且大多只針對多環芳烴類石油烴進行了研究。例如，劉沙沙等[9]發現微黃分枝桿菌對芘有著良好的增溶與降解作用。Wu等[10]發現結核分枝桿菌能夠在以芴和蒽為唯一碳源的培養基中快速生長并起到良好的降解作用。Sun等[11]發現嗜芳族分枝桿菌可通過雙加氧酶降解菲。現有研究大多只報道了分枝桿菌的多環芳烴降解能力，對柴油類石油烴的降解研究鮮有報道，因此針對分枝桿菌進行柴油的降解研究對該菌屬的降解多樣性具有重要的推動作用。

本研究基于含油污泥篩選得到一株柴油降解菌Mycolicibacterium fluoranthenivoransY3，并對其進行系統發育分析，考察菌株的生長特性及以柴油為底物的條件下菌株的柴油耐受程度和降解特性，通過GC-MS進一步研究其降解能力與機制，研究結果可推進分枝桿菌屬對石油烴降解的多樣性并為石油烴污染的原位修復提供重要種質資源。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與培養基

柴油為車用0#柴油，石油醚為國產分析純，氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析用試劑為高效液相色譜純，分子生物學試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

菌種篩選材料取自天津港南疆污水處理廠（38.97°N，117.77°E），該污水處理廠進水常年以港口、船舶含油污水及生活污水為主，污水中所含石油主要為柴油、燃料油等，污水經斜板隔油+混凝沉淀處理后得到的含油污泥置于曬泥場晾曬，取曬泥場0～10 cm深處油泥作為菌種篩選材料。

（1）無機鹽培養基：NaCl 1 g，NH4Cl 1.34g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， 1L去離子水，pH 7.0（固體培養基加20 g/L瓊脂）。

（2）柴油培養基：無機鹽培養基中添加1%（V/V）柴油。

（3）LB培養基：含牛肉膏5 g，蛋白胨10 g， NaCl 5 g，pH為7.0（固體培養基加20 g/L瓊脂）。

1.2 實驗方法

1.2.1 柴油降解菌的篩選

從天津港南疆污水處理廠采集含油污泥作為菌株篩選材料，稱取5 g油泥樣品制成油泥水混合液，將其按5%（V/V）接種量加入到柴油含量為0.5%（V/V）的無機鹽培養基中，置于30℃搖床上以180 r/min的轉速震蕩培養3～5 d，待培養液明顯渾濁后，將培養液以5%（V/V）接種量轉接于新鮮的柴油培養基中（柴油濃度依次為：1%、2%、3%），如此共富集培養三輪，取完成富集的菌液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6，各吸取200 μL稀釋后菌液均勻涂布于含柴油的無機鹽固體培養基（無機鹽固體培養基表面均勻涂布 200 μL柴油）中，30℃培養2～3 d，挑取不同菌落形態的單菌落連續純化3次，得到若干株細菌，分別接種于柴油培養基中，5 d后測定柴油的降解率，選擇對柴油降解率最高的菌株命名為Y3（初步柴油降解率為42.5%）進行后續實驗。

1.2.2 形態學及生理生化鑒定

菌落的生長狀況、菌株的形態特征以及菌株的生理生化測試按照《常見細菌系統鑒定手冊》進行初步判定，并采用掃描電鏡（JSMIT300LV）在10000倍下觀察Y3形態。

1.2.3 分子生物學鑒定

采用16S rDNA序列分析方法鑒定Y3菌株，由金唯智生物科技有限公司完成測序工作，測序結果用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件NCBI中的已知序列進行同源性比對，利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，并在Genebank申請16S rDNA保藏號。

1.2.4 種子液的獲取

取保存菌種，于LB平板劃線，30℃恒溫培養48 h，挑取單菌落接種于20 mL LB培養基中，于30℃、180 r/min搖床培養12 h。

1.2.5 菌株的生長特性研究

將種子液以5%接種量接種至LB培養基中，考察在不同初始pH（5、6、7、8、9）、不同溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、不同NaCl濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L）、不同金屬離子（Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+各 50 mg/L）等因素對菌株生長的影響。各個試驗中的固定條件為：pH=7、溫度為30℃、無NaCl、無金屬離子，NaCl與金屬離子不作為生長特性試驗的主要條件。實驗中以不接菌的LB培養基作為空白對照，測定菌株的OD600表征菌量。

1.2.6 柴油降解曲線

將種子液以5%（V/V）的接種量接種于柴油培養基中，30℃、180 r/min培養7 d，以不接菌的柴油培養基為對照，測定菌株的OD600及柴油降解率。

1.2.7 接種量對柴油降解效果的影響

將種子液分別以1%、3%、5%、10%、15%（V/V）的接種量接種于柴油培養基中，30℃、180 r/min培養5d，以不接菌的柴油培養基為對照，測定菌株的OD600及柴油降解率。

1.2.8 不同條件對菌株Y3降解柴油的影響

將種子液以5%接種量接種至柴油培養基中，考察不同柴油濃度（0.5%、1%、2%、3%）、初始pH（5、6、7、8、9）、溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、外加碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、碳酸鈉、乙酸鈉，投加濃度均為100 mg/L）、氮源（氯化銨、酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鈉，投加濃度均為1.34 g/L）等因素對菌株生長和降解效果的影響。各個試驗中的固定條件為：柴油濃度1%（V/V）、pH=7、溫度為30℃，碳氮源為外加條件，不作為降解試驗的主要條件。以不接菌的柴油培養基作為空白對照，測定菌株的OD600及柴油降解率。

1.2.9 菌株Y3降解柴油的組分分析

將種子液以5%接種量接種至柴油培養基，在最優條件下（柴油濃度1%（V/V）、30℃、pH=6）培養5 d，利用正己烷萃取最終發酵液中柴油等有機組分，在萃取液中加入無水硫酸鈉直至不再結塊，取上清液適當稀釋，于氣相色譜-質譜儀測定發酵液成分。

1.3 分析測定方法

1.3.1 柴油的測定

以石油醚為萃取劑，采用液液萃取的方法，萃取無機鹽液體培養基中的柴油，并采用紫外分光光度法在225 nm處測定其濃度[12]。按式（1）計算柴油降解率。

式中：C0—空白培養基柴油的濃度；C1—實驗培養基柴油的濃度。

1.3.2 氣相色譜-質譜儀分析條件

氣相色譜條件（GCMS-QP2020）：色譜柱Rxi-5Sil（0.25 mm×30 m×0.25 μm）；進樣量 1 μL，不分流；柱溫升溫程序：40℃保持5 min，以10℃/min升至290℃，保持10 min，再以15℃/min升至310℃，保持2 min。

質譜條件：EI源，離子源溫度220℃，接口溫度200℃。溶劑延遲時間2.5 min，掃描范圍35～500 amu，自動調諧。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

通過柴油培養基培養、篩選和分離，純化得到1株高效柴油降解菌株Y3。通過革蘭氏染色實驗確定菌株Y3為革蘭氏陰性菌，其菌落形態為圓形，白色，表面濕滑不透明，邊緣整齊，其生理生化特性見表1，掃描電鏡照片及菌落形態特征如圖1所示。

圖1 菌株Y3形態圖

表1 菌株的生理生化實驗結果

以菌株Y3的DNA為模板，利用通用引物擴增得到1387 bp的16S rRNA基因片段。通過在基因序列數據庫中的比對分析發現其與Mycolicibacterium fluoranthenivoransFA-4的同源性達99.78%。將Y3與分枝桿菌進行系統發育分析如圖2所示，菌株Y3的16S rRNA基因序列GenBank登陸號為OM149383。

圖2 菌株Y3基于16SrRNA基因序列的系統發育分析

2.2 菌株的生長特性

不同溫度、pH、NaCl濃度、金屬離子對菌株Y3生長的影響，如圖3所示。

菌株Y3在20～40℃的溫度范圍內生長較好，30℃獲得了最佳生長，屬于中溫菌（圖3-a）。在6.0～8.0的pH范圍內菌株生長良好，pH =6.0條件下菌株獲得最佳生長，pH=5.0的條件下菌株生長受到嚴重抑制，說明菌株Y3適宜在中性偏酸性的環境中生存（圖3-b）。Y3在鹽度范圍為3%以內均可生長，具有良好的耐鹽性（圖3-c）。菌株Y3在50 mg/L的Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+條件下均能生長，與對照組相比Co2+完全抑制了菌株的生長，Ni2+、Zn2+、Cu2+的抑制作用相對較弱，Mn2+則無明顯的抑制作用（圖3-d）。

圖3 菌株的生長特性

2.3 菌株的柴油降解特性

2.3.1 降解曲線

Y3對柴油的降解曲線，如圖4所示。在7 d的培養過程中，菌株Y3持續生長，同時柴油降解率也不斷提高，直至第5 d，OD600達到最高值，柴油降解率可達46.7%，隨后趨于平穩，因此后續降解實驗時長以5 d為宜。

圖4 菌株的柴油降解曲線

2.3.2 菌株的降解特性

由圖5可知，隨著接種量逐漸提高，菌株的OD600和柴油降解率也隨之升高，當接種量為10%（V/V）時，菌株的OD600和柴油降解率最高，接種量超過10%（V/V）時，菌株的生長量和柴油降解率略有降低（圖5-a）。由此可知，單純提高接種量并不能顯著提升菌株的柴油降解率，接菌量過大，會引起細菌競爭營養物質而使部分細菌死亡[13]。當接種量為5%，柴油濃度在1%（V/V）以內，菌株Y3生長旺盛，對柴油的降解率均在40%以上，而隨著柴油濃度的提升，菌株的生長受到抑制，OD600僅為0.7左右，降解率大幅下降，后續實驗均選擇1%（V/V）柴油濃度進行（圖5-b）。菌株Y3在30℃條件下柴油降解率最高，可達48.1%，溫度為20℃和40℃時，發酵液相對澄清，Y3的生長與降解能力明顯下降 （圖5-c）。可見溫度過高或過低，都會抑制微生物的代謝活動[14]。在pH為5的高酸性環境，菌株Y3難以生長，對柴油的降解率僅有10%，而在pH為6的弱酸環境下，Y3對柴油的降解效果最好，降解率可達55%（圖5-d）。碳酸鈉對Y3降解柴油的促進效果明顯，柴油降解率由47.2%提升至71.2%（圖5-e）。氯化銨為Y3降解柴油過程中的最佳氮源（圖5-f）。

圖5 菌株Y3的降解特性

2.4 柴油降解的GC-MS分析

長期的含柴油、燃料油潮濕泥土環境使菌株耐受碳氫化合物污染環境，而柴油富含長鏈烷烴，且燃料油中約含有52%的芳烴組分，使其很難被生物降解[15]，從此環境中篩選得到的菌株Y3也由此具備了良好的碳氫化合物環境耐受性與降解能力。與未接菌的對照CK相比，在最適培養條件下培養5 d后菌株Y3對柴油中各組分（C10-C32）均有一定的降解效果，柴油各單一組分發生明顯變化（圖6）。菌株Y3對柴油中的直鏈烷烴具有良好的降解效果，均達到30%以上的降解率，其中正十六烷、正十九烷、正三十二烷的降解率分別達到47.8%、71.2%與51.2%，Y3對支鏈烷烴也有著一定降解能力，其中2,6,10-三甲基十三烷降解率高達57.6%（圖7）。與菌株Y3相比，Ivanovaa等[16]篩選得到的嗜酸分枝桿菌對輕質低粘度油（體積分數為0.5%～1%）的正構烷烴和異烷烴降解率分別為99%和44%， Kim等[17]利用Mycobacterium vanbaalenii-PYR-1菌株對十二烷、十三烷、十六烷、二十烷、二十四烷、二十五烷和二十八烷（體積分數為1%）進行降解，發現其對十二烷、十三烷降解速度最快，分別為62%和68%，而其他烷烴降解率為20%～30%。這與菌株Y3降解特性相似，這種降解趨勢在大多數代謝烷烴的分枝桿菌中較為典型[18]。但值得注意的是，以上研究中菌株對烷烴的降解時間分別長達28 d和30 d，而Y3僅用5 d即達到上述水平，可見Mycolicibacterium fluoranthenivoransY3有較高的烷烴降解效率。

圖6 柴油降解的GC-MS分析

圖7 菌株Y3對柴油各組分利用情況

鑒于上述研究的分析比較結果以及分枝桿菌對多環芳烴降解研究的普遍性[19,20]，可見MycolicibacteriumfluoranthenivoransY3具有較為獨特與高效的石油烴降解能力，同時，螢蟲分枝桿菌（Mycolicibacterium fluoranthenivorans）的柴油烷烴降解特性是首次進行研究，填補了分枝桿菌降解柴油相關研究的空白，對分枝桿菌屬修復石油烴污染的研究具有重要的推動意義。

3 結論

（1）從天津港南疆污水處理廠含油污泥中篩選得到MycolicibacteriumfluoranthenivoransY3菌株，具有良好的耐鹽性以及耐Mn2+的能力。

（2）Y3能耐受3%（V/V）的柴油，在柴油濃度為1%（V/V）、接種量為10%（V/V）、溫度為30℃、pH為6.0的條件下，降解柴油第5 d可達50.1%的降解率。

（3）Y3可降解柴油中所有的碳氫化合物（C10-C32），能夠較好地利用直鏈或支鏈烷烴，在柴油等石油烴污染修復領域具有良好的應用價值。