短期牦牛放牧對(duì)青藏高原高寒草地土壤真菌群落的影響

王永宏，田黎明，艾鷖，陳仕勇，澤讓東科*

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川若爾蓋高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀察研究站，四川成都 610041；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610065；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

青藏高原是全球海拔最高、面積最大的高原，具有極其重要的生態(tài)價(jià)值［1］。高寒草地約占青藏高原總面積的60%［2］，是全球最獨(dú)特的草地生態(tài)系統(tǒng)之一，在保護(hù)青藏高原生物多樣性方面發(fā)揮著重要的生態(tài)作用，同時(shí)維持著區(qū)域的經(jīng)濟(jì)發(fā)展［3］。青藏高原是我國(guó)主要牧區(qū)之一［4］，放牧作為主要的草地利用方式，對(duì)青藏高原的經(jīng)濟(jì)發(fā)展與生態(tài)環(huán)境具有重要影響［5］。然而，隨著放牧強(qiáng)度嚴(yán)重超載，加之氣候變暖，最終導(dǎo)致青藏高原高寒草甸發(fā)生了不同程度的退化［6-7］。持續(xù)高強(qiáng)度放牧?xí)?duì)草地造成不可恢復(fù)的損害，但單一限制牧民放牧?xí)璧K青藏高原的經(jīng)濟(jì)發(fā)展［8］。因此，探究青藏高原地區(qū)牦牛放牧、經(jīng)濟(jì)發(fā)展與草地生態(tài)健康的平衡具有重要社會(huì)意義。

微生物是生態(tài)系統(tǒng)中主要的分解者之一，微生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能直接相關(guān)，微生物豐富度越高，群落功能越穩(wěn)定［9］。放牧通過(guò)采食、踐踏與排泄行為影響土壤性質(zhì)和微生物群落，家畜會(huì)通過(guò)排泄方式返還給土壤部分碳［10］，家畜的消化與分解過(guò)程，會(huì)使排泄物結(jié)構(gòu)變簡(jiǎn)單，從而利于微生物的利用與生長(zhǎng)。放牧行為會(huì)影響土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)，放牧強(qiáng)度也會(huì)對(duì)微生物群落產(chǎn)生極大的影響。放牧強(qiáng)度過(guò)高會(huì)改變土壤的容重，降低植被覆蓋度，增加土壤表面的紫外線強(qiáng)度，改變土壤溫度，從而使微生物的生長(zhǎng)條件惡化［11］，導(dǎo)致微生物生物量下降。土壤真菌的底物為難分解的有機(jī)質(zhì)，在放牧地的土壤微生物群落競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，土壤微生物群落向以細(xì)菌為主的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變［12］。但Wang等［13］通過(guò)添加不同形式的碳發(fā)現(xiàn)真菌主要同化不穩(wěn)定碳，雖然對(duì)葡萄糖利用能力不及細(xì)菌，但當(dāng)葡萄糖碳可用性增加時(shí)，真菌是固定葡萄糖碳的關(guān)鍵競(jìng)爭(zhēng)類群。放牧通過(guò)多種方式影響土壤真菌群落，但牦牛放牧強(qiáng)度對(duì)于真菌群落的影響仍不清楚。

全球范圍的研究表明，土壤真菌的豐富度和植物多樣性僅存在微弱的關(guān)系，并提出氣候因素、土壤和空間變量是真菌豐富度與群落結(jié)構(gòu)的最佳預(yù)測(cè)因子［14］。針對(duì)青藏高原的研究表明在考慮環(huán)境因子時(shí)真菌豐富度與植物豐富度呈正相關(guān)，但氣候、空間和土壤仍是真菌群落組成的主要預(yù)測(cè)因子［15］。放牧作為草地利用的主要形式之一，許多研究揭示了其對(duì)真菌群落的影響［16-19］。例如，青藏高原圍封試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)放牧活動(dòng)會(huì)降低土壤有機(jī)碳，間接增加真核生物的豐富度與多樣性［16］；究其原因主要是放牧通過(guò)減少土壤碳輸入使土壤pH升高，從而為真菌生長(zhǎng)提供更適合的條件，使土壤真菌的α多樣性與土壤pH呈正相關(guān)［17］。將真菌根據(jù)功能群進(jìn)一步劃分后發(fā)現(xiàn)，不同的真菌功能群對(duì)放牧的響應(yīng)并不相同：放牧?xí)黾诱婢S腐菌、降低植物病原菌，兔子放牧降低了外生菌根和叢枝菌根真菌［18-19］；通過(guò)全球范圍草地的整合分析發(fā)現(xiàn)重度和中度放牧?xí)档蛥仓婢S度，而輕度放牧的影響卻不顯著［20］。前期研究表明土壤因子是放牧影響土壤真菌的重要媒介之一，但放牧對(duì)土壤的影響具有一定的滯后性，因此短期放牧對(duì)土壤化學(xué)計(jì)量的影響并不顯著［21］，然而短期放牧對(duì)土壤真菌是否有影響及其影響方式報(bào)道較少。

真菌群落的生態(tài)功能，是通過(guò)物種之間的相互作用實(shí)現(xiàn)的，物種間的競(jìng)爭(zhēng)、協(xié)作等過(guò)程直接或間接相互聯(lián)系，形成一個(gè)復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)［22］。網(wǎng)絡(luò)分析能夠通過(guò)模塊化量化共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的相互作用程度，進(jìn)一步細(xì)分了真菌類群的生態(tài)功能［23］。以往的研究中將真菌群落作為一個(gè)整體，探究其多樣性及豐度對(duì)放牧活動(dòng)的響應(yīng)；或者僅研究特定的功能群對(duì)于放牧的響應(yīng)，忽略了不同真菌間的競(jìng)爭(zhēng)與合作關(guān)系。真菌群落擁有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，不同真菌類群間具有怎樣的相互作用及其相互作用是否會(huì)削弱特定真菌類群對(duì)外界干擾的響應(yīng)仍需進(jìn)一步探究。

本研究在川西北高寒草甸進(jìn)行短期（2年）不同強(qiáng)度牦牛放牧處理，利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，通過(guò)不同真菌物種的共現(xiàn)特征進(jìn)行真菌類群劃分，研究牦牛短期放牧對(duì)土壤真菌群落構(gòu)成是否有影響，若有影響是通過(guò)何種方式實(shí)現(xiàn)的，從而為高寒草甸放牧管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)在“四川若爾蓋高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀察研究站”進(jìn)行，位于青藏高原東緣四川省阿壩藏族羌族自治州（32°48'N，102°33'E），試驗(yàn)區(qū)年均氣溫1.5℃、年均降水750 mm，海拔為3504 m。試驗(yàn)地優(yōu)勢(shì)植物種為垂穗披堿草（Elymus nutans）、高山嵩草（Kobresia pygmaea）、矮嵩草（Kobresia humilis），植被類型為典型高寒草甸。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

于2014年選取一處典型高寒草甸夏季牧場(chǎng)進(jìn)行圍封，圍封一年確保草地初始狀況較為均一，2015年5月進(jìn)行放牧試驗(yàn)，牦牛的放牧?xí)r間為每年的5月下旬到9月下旬。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為3個(gè)放牧處理和一個(gè)對(duì)照處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)；放牧處理為輕度放牧（1頭牦牛·hm-2）、中度放牧（2頭牦牛·hm-2）與重度放牧（3頭牦牛·hm-2），對(duì)照處理為圍封禁牧。試驗(yàn)地總面積為10 hm2，其中每個(gè)放牧處理樣地面積為1 hm2，每個(gè)對(duì)照處理樣地面積均為0.33 hm2，樣地的詳細(xì)情況見(jiàn)Mipam等［21，24］的報(bào)道。試驗(yàn)期間每個(gè)月對(duì)每塊樣地隨機(jī)選取4個(gè)點(diǎn)，進(jìn)行植物群落調(diào)查與生物量樣品收集。于放牧處理第2年8月底采集土壤樣品，對(duì)每塊樣地隨機(jī)選取4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)用土鉆采集5個(gè)0～10 cm的土柱混合為一個(gè)土壤樣品；土壤樣品分為兩部分，一部分陰干用于土壤理化性質(zhì)檢測(cè)，另一部分低溫保存用于土壤真菌群落測(cè)定。

1.3 環(huán)境因子測(cè)定

植物群落豐富度通過(guò)計(jì)算每個(gè)調(diào)查的樣方的植物物種數(shù)來(lái)確定，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)根據(jù)以下公式計(jì)算：

式中：H為Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，J為Pielou均勻度指數(shù)，S為物種豐富度，Pi為每個(gè)樣方中的物種i的相對(duì)重要性，其計(jì)算方法為物種i的個(gè)體數(shù)與樣方總個(gè)體數(shù)的比值。植物凈生產(chǎn)力使用可移動(dòng)扣籠法估計(jì)，其方法為在每個(gè)放牧區(qū)放置4個(gè)可移動(dòng)扣籠，在試驗(yàn)期每月收獲可移動(dòng)扣籠內(nèi)與外的生物量，并在收獲完當(dāng)月生物量后隨機(jī)移動(dòng)扣籠，通過(guò)籠內(nèi)與籠外收獲生物量的差值獲得當(dāng)月的家畜消耗量，估算各試驗(yàn)地凈初級(jí)生產(chǎn)力。

采用烘干法測(cè)定土壤含水率，環(huán)刀法測(cè)定土壤容重；將陰干土壤揀除草根、石塊等雜物后用研砵碾碎，過(guò)2 mm篩后用于土壤全效養(yǎng)分檢測(cè)，采用電位法測(cè)定土壤pH，重鉻酸鉀氧化外加熱法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)，凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮，NaOH熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷，火焰分光光度計(jì)法測(cè)定土壤全鉀；用過(guò)0.15 mm篩的陰干土壤測(cè)速效養(yǎng)分，采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮含量，NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤速效磷，乙酸銨浸提-火焰光度計(jì)法測(cè)定土壤速效鉀，以上所有測(cè)定方法均參照鮑士旦［25］。

1.4 土壤真菌群落測(cè)定

土壤總DNA用QIAamp? DNA Stool Mini Kit（QIAGEN，德國(guó)）試劑盒進(jìn)行提取，用引物ITS5-1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS2-2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對(duì)真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR過(guò)程為：通過(guò)98℃保持30 s進(jìn)行預(yù)變性，然后進(jìn)入循環(huán)；循環(huán)過(guò)程為98℃變性15 s、降到50℃退火30 s、72℃延伸30 s完成循環(huán)，循環(huán)次數(shù)為25～27次；最后72℃保持5 min，于4℃保存。回收PCR產(chǎn)物后在Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）上進(jìn)行定量，用Illumina公司的TruSeq Nano DNALT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.5 生信分析

將原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù)利用滑動(dòng)窗口法進(jìn)行質(zhì)控，窗口設(shè)置為10 bp，步長(zhǎng)設(shè)置為1 bp，從5'端進(jìn)行窗口滑動(dòng)，窗口的堿基平均測(cè)序準(zhǔn)確率≥99%（Q20），從第一個(gè)平均質(zhì)量低于該標(biāo)準(zhǔn)的窗口進(jìn)行截?cái)啵コ財(cái)嗪笮∮?50 bp和含有模糊堿基N的序列。使用軟件FLASH（v1.2.7）將Read1與Read2進(jìn)行堿基配對(duì)，重疊堿基長(zhǎng)度≥10 bp，最后根據(jù)Barcode序列對(duì)樣本進(jìn)行拆分。使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology，v1.8.0）的USEARCH（v5.2.236）去除嵌合體序列，調(diào)用UCLUST工具，進(jìn)行序列比對(duì)，將序列按照97%的相似度進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的劃分，選取豐度高的序列作為代表序列，將代表序列與UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行分類學(xué)注釋。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS對(duì)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05）。使用QIIME計(jì)算真菌的α多樣性指數(shù)，用R的aov函數(shù)對(duì)α多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析；用R的mixOmics包進(jìn)行有監(jiān)督判別分析，對(duì)不同放牧強(qiáng)度處理的組間差異進(jìn)行分析，并進(jìn)行可視化；使用R的Hmisc包進(jìn)行所有處理OTU的相關(guān)分析，保留大于0.6的相關(guān)關(guān)系，用Gephi可視化真菌共生網(wǎng)絡(luò)并計(jì)算模塊性，并將真菌模塊的相對(duì)豐度與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析；用R的pacman包進(jìn)行環(huán)境因子的篩選，將真菌門(mén)分類水平下的相對(duì)豐度用篩選出的環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析（redundancy analysis，RDA），并將預(yù)測(cè)因子進(jìn)行分類，對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行方差分解（variance partitioning analysis，VPA）。用R的ggplot 2包可視化真菌的群落組成與真菌模塊結(jié)構(gòu)；用R的aov函數(shù)對(duì)各模塊的相對(duì)豐度進(jìn)行單因素方差分析，用TukeyHSD函數(shù)進(jìn)行多重比較，并可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放牧強(qiáng)度對(duì)環(huán)境因子的影響

由表1可知，短期放牧處理下放牧強(qiáng)度間植物群落特征差異比土壤性質(zhì)更大，植物多樣性隨放牧強(qiáng)度的增加而增加，中度與重度放牧顯著增加了植物群落多樣性（P＜0.05）；均勻度呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，但僅有重度放牧相比于對(duì)照顯著增加了植物均勻度；放牧?xí)黾又参锶郝涞牡厣蟽舫跫?jí)生產(chǎn)力，并且輕度與中度放牧強(qiáng)度顯著增加了植物群落的生產(chǎn)力，中度放牧的草地生產(chǎn)力最高。不同放牧強(qiáng)度的土壤容重存在顯著差異，輕度放牧與重度放牧顯著降低了土壤容重；土壤化學(xué)性質(zhì)方面，放牧強(qiáng)度增加使土壤速效磷含量升高，并且重度放牧與對(duì)照相比顯著增加；土壤pH在不同放牧強(qiáng)度間具有顯著差異，放牧活動(dòng)使土壤酸性增強(qiáng)，中度放牧的土壤pH值最小，顯著小于對(duì)照組和輕度放牧。

表1 不同放牧強(qiáng)度對(duì)環(huán)境因子的影響Table 1 Effect of different grazing intensities on environmental factors

2.2 不同放牧強(qiáng)度對(duì)土壤真菌群落的影響

2.2.1土壤真菌群落的組成 結(jié)果表明，土壤真菌群落主要由子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）和 接 合 菌 門(mén)（Zygomycota）組 成，還 包 括 少 量 的 球 囊 菌 門(mén)（Glomeromycota）、隱 真 菌 門(mén)（Rozellomycota）和壺菌門(mén)（Chytridiomycota）；其中土壤中子囊菌門(mén)數(shù)量最多，輕度、中度、重度的相對(duì)豐度比對(duì)照分別增加了31.05%、7.69%、40.53%；而作為土壤真菌群落另一主要組成成分，擔(dān)子菌門(mén)在輕度、中度、重度的相對(duì)豐度比對(duì)照組分別降低了37.34%、17.10%、47.42%。測(cè)序結(jié)果還包含了原生生物纖毛蟲(chóng)門(mén)（Ciliophora）和絲足蟲(chóng)門(mén)（Cercozoa）與植物界的被子門(mén)（Anthophyta），但其相對(duì)豐度值較低，不影響土壤真菌的整體群落結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2.2土壤真菌群落的α多樣性 土壤真菌群落的α多樣性指數(shù)在不同放牧強(qiáng)度中均無(wú)顯著差異（表2）。Chao1豐富度指數(shù)利用群落中檢測(cè)到1和2次的OTU數(shù)估算群落的物種數(shù)。Chao1豐富度指數(shù)隨放牧強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，輕度放牧的豐富度最高，中度放牧與重度放牧的土壤真菌Chao1豐富度指數(shù)值大致相同。放牧處理同樣具有土壤真菌多樣性增加的趨勢(shì)，但重度放牧的Shannon多樣性指數(shù)最大，其多樣性最高。

表2 不同放牧強(qiáng)度土壤真菌群落α多樣性的單因素方差分析結(jié)果Table 2 Results of One-way ANOVA analysis of soil fungal community α diversity at different grazing intensities

2.2.3土壤真菌群落的組間差異分析 結(jié)果表明，偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）的兩個(gè)坐標(biāo)軸的解釋度分別為11.5%和11.6%；其中對(duì)照組和重度放牧兩個(gè)處理的組內(nèi)各樣本距離近，組內(nèi)重復(fù)效果好；中度放牧與對(duì)照組距離最近，其對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最小，重度放牧對(duì)土壤真菌群落的影響最為明顯。對(duì)照組處于排序的中間位置，可見(jiàn)不同的放牧強(qiáng)度對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響是不同的（圖2）。

2.3 土壤真菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

基于真菌群落OTU數(shù)據(jù)相關(guān)性構(gòu)建了共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖，共得到了308個(gè)節(jié)點(diǎn)、3078條邊的真菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。對(duì)真菌網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分后，得到模塊化值為0.936的模塊網(wǎng)絡(luò)，并劃分為4個(gè)主要的模塊。模塊1包含OTUs種類最多，共有94個(gè)節(jié)點(diǎn)，占網(wǎng)絡(luò)總數(shù)的30.52%；其次為模塊2，共有84個(gè)節(jié)點(diǎn)，占網(wǎng)絡(luò)總節(jié)點(diǎn)數(shù)的27.27%；模塊3由57個(gè)節(jié)點(diǎn)組成，占網(wǎng)絡(luò)總節(jié)點(diǎn)數(shù)的18.51%；模塊4包含了27個(gè)節(jié)點(diǎn)，占網(wǎng)絡(luò)總數(shù)的8.77%。其中模塊2節(jié)點(diǎn)連通度高，和其他節(jié)點(diǎn)的相互作用更強(qiáng)，對(duì)真菌群落的影響更加強(qiáng)烈（圖3A）。

子囊菌門(mén)作為土壤中主要的真菌類群，也是4個(gè)模塊的主要組成部分。作為組成種類最豐富的模塊，模塊1的子囊菌門(mén)真菌由52種OTUs組成，其在模塊1的相對(duì)豐度為56.09%；而擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度為41.37%，包括31個(gè)OTUs種類，是各個(gè)模塊中擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度最高的模塊。模塊2未能識(shí)別的真菌豐度增加；但其主要組成類群子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度為59.51%，由46種真菌組成；擔(dān)子菌門(mén)包含了16種真菌，在模塊2的相對(duì)豐度為12.56%。模塊3則基本由子囊菌門(mén)組成，其子囊菌門(mén)包括了25種OTUs，相對(duì)豐度則為82.51%。模塊4是4個(gè)主要模塊結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的，其子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度也是4個(gè)模塊中最少的（33.13%），僅包含11種OTUs；擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度為17.45%，由9個(gè)真菌種組成；模塊4的接合菌門(mén)相對(duì)豐度相對(duì)于其他模塊明顯增加，雖然只包含2種OTUs，但其相對(duì)豐度為18.54%（圖3B）。

2.4 不同放牧強(qiáng)度對(duì)土壤真菌模塊的影響

模塊1、模塊2與模塊3在不同放牧強(qiáng)度的相對(duì)豐度差異不顯著。模塊1的相對(duì)豐度隨放牧強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，模塊1的輕度放牧相對(duì)豐度最高；模塊3的放牧處理相對(duì)豐度均高于對(duì)照處理，并隨著放牧強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)；雖然模塊4的相對(duì)豐度最少，但其對(duì)于放牧強(qiáng)度的響應(yīng)最強(qiáng)烈，模塊4的重度放牧相對(duì)豐度顯著高于（P＜0.1）對(duì)照組，而輕度放牧和中度放牧與對(duì)照差異不顯著，與重度放牧差異也不顯著（圖4）。

2.5 土壤真菌與環(huán)境因子的關(guān)系

2.5.1環(huán)境因子對(duì)真菌群落的影響 通過(guò)對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行共線性排除與模型篩選，選擇植物群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和土壤化學(xué)性質(zhì)全磷、全鉀、速效磷以及速效鉀作為真菌門(mén)分類水平的預(yù)測(cè)因子進(jìn)行冗余分析，第一、二解釋軸的解釋度分別為43.67%和25.02%，組成真菌群落的主要類群子囊菌門(mén)受土壤速效磷與植物群落多樣性的影響，擔(dān)子菌門(mén)則與土壤全鉀和速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系（圖5A）。進(jìn)一步對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行方差分解后發(fā)現(xiàn)，土壤因子對(duì)真菌類群變化的解釋度更高，其排除植物因子的解釋度為39.1%，而植物因子排除土壤的解釋度為4.9%（圖5B）。

2.5.2環(huán)境因子與真菌模塊間的關(guān)系 由圖6可知，植物群落特征與各真菌模塊相關(guān)性較弱，作為真菌群落的主要組成類群，模塊1與模塊2對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)是相反的，均受到土壤全磷與全鉀的顯著影響，土壤的全磷與全鉀含量與模塊1的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與模塊2顯著負(fù)相關(guān)。模塊3是受土壤性質(zhì)影響最多的真菌類群，與堿解氮、速效磷等土壤速效養(yǎng)分呈顯著正相關(guān)，也受到土壤物理性質(zhì)的影響，與土壤含水率極顯著正相關(guān)，與土壤容重極顯著負(fù)相關(guān)。模塊4受環(huán)境影響相對(duì)較小，僅與土壤全鉀呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

3.1 短期處理下放牧強(qiáng)度對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

多年禁牧試驗(yàn)表明放牧通過(guò)提高堿性土壤pH和土壤溫度增加青藏高原土壤真核生物的多樣性與豐富度［16］；但也有研究表明放牧強(qiáng)度對(duì)真菌群落的影響是通過(guò)提高子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，進(jìn)而通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥的過(guò)程間接降低真菌豐富度與多樣性［26］。通過(guò)對(duì)短期放牧不同強(qiáng)度真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，放牧處理均增加了土壤中子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，但真菌豐富度和多樣性均呈現(xiàn)大于對(duì)照組的趨勢(shì)，與之前的研究結(jié)果并不完全相同。本研究各處理間的α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著，其可能的原因是高寒牧場(chǎng)的土壤性質(zhì)與微生物群落對(duì)短期放牧強(qiáng)度梯度處理具有較強(qiáng)的抵抗力［27］；另一方面，由于試驗(yàn)區(qū)域較大從而導(dǎo)致土壤微生物空間異質(zhì)性較高。

本研究結(jié)果表明，土壤因子解釋了真菌群落變異的39.1%，是真菌群落變化的主要驅(qū)動(dòng)因子，與之前的研究結(jié)果相似［14-15］。作為研究區(qū)土壤真菌的主要組成部分，放牧處理的子囊菌門(mén)相比于對(duì)照組均有不同程度的增加，輕度放牧與重度放牧的子囊菌門(mén)相對(duì)豐度明顯增加，與楊文高［28］在牦牛糞便分解試驗(yàn)中牛糞分解增加子囊菌門(mén)豐度的結(jié)果一致。子囊菌門(mén)是牛糞分解過(guò)程中的主導(dǎo)類群，其在牛糞分解過(guò)程中分泌大量的纖維素與半纖維素分解酶，并利用牛糞中的有機(jī)質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)成分［29］，同時(shí)放牧使植物與牛糞碎屑等混入土壤中，使土壤中的纖維素含量增加。此外，子囊菌門(mén)的底物具有廣譜性，通過(guò)不穩(wěn)定碳激活后，可以利用有機(jī)碳等天然穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作為底物［30］，因而放牧活動(dòng)過(guò)程中家畜排泄的不穩(wěn)定碳可能進(jìn)一步促進(jìn)子囊菌門(mén)對(duì)有機(jī)質(zhì)的利用。并且子囊菌門(mén)與植物多樣性呈正相關(guān)，放牧強(qiáng)度增加引起的植物多樣性增加，從而增加根系分泌物的種類［31］，進(jìn)一步促進(jìn)子囊菌門(mén)對(duì)有機(jī)質(zhì)的利用。土壤氮磷循環(huán)具有強(qiáng)烈的相互作用，土壤磷可以促進(jìn)氮的礦化［32］，提高土壤的有效氮進(jìn)而改變微生物群落。土壤微生物相比于植物來(lái)說(shuō)生長(zhǎng)速度更快，其遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)磷有更高的需求，因此土壤微生物比植物更容易受到磷的限制［33］。子囊菌門(mén)相比于擔(dān)子菌門(mén)的生長(zhǎng)速度更快［34］，放牧處理土壤中較高的磷含量為其快速繁殖提供了條件。相反，擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度在各放牧處理均降低，對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的抵御能力低于子囊菌門(mén)，其可能原因是擔(dān)子菌門(mén)是主要以木質(zhì)素為底物的寡養(yǎng)性真菌［35］，放牧活動(dòng)使其底物濃度降低。此外，土壤的物理結(jié)構(gòu)決定了真菌的群落結(jié)構(gòu)，擔(dān)子菌門(mén)真菌的菌絲體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，菌絲分枝角較小，菌絲節(jié)間長(zhǎng)，菌絲體內(nèi)部孔隙較少；而作為土壤中另一類主要的真菌類群，子囊菌門(mén)菌絲體的孔隙率高，對(duì)空間的侵占能力更強(qiáng)［36］。本研究中，輕度放牧和重度放牧的土壤表層容重顯著低于對(duì)照組，土壤孔隙度的增加為子囊菌門(mén)提供了更有利的繁殖條件。

3.2 土壤真菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)及其模塊

微生物網(wǎng)絡(luò)模塊的形成主要有兩個(gè)原因，一是環(huán)境因子對(duì)微生物的選擇使模塊類群具有不同于其他模塊的生態(tài)位，二是模塊類群中的微生物具有較強(qiáng)的相互作用［37］。微生物群落實(shí)現(xiàn)其功能有兩種不同的形式，較高的微生物豐富度造成較大的功能冗余以確保單個(gè)功能；或較高的微生物豐富度形成較大的功能多樣性，從而同時(shí)支持多個(gè)功能［38-39］。本研究的真菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)根據(jù)真菌類群的相互作用劃分為4個(gè)主要的模塊，由于其組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，加上短期放牧對(duì)土壤性質(zhì)影響較小，放牧強(qiáng)度對(duì)模塊1、2、3的影響不顯著；模塊4的相對(duì)豐度最小且組成分類更豐富，對(duì)土壤條件變化敏感，重度放牧的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，表明模塊豐度越高（模塊結(jié)構(gòu)越復(fù)雜），抵抗外界干擾的能力越強(qiáng)。Hernandez等［37］得到的微生物群落網(wǎng)絡(luò)沿脅迫梯度模塊化程度降低的結(jié)果，表明高脅迫環(huán)境的模塊結(jié)構(gòu)更少，即模塊結(jié)構(gòu)越大對(duì)外界脅迫的抵抗能力越強(qiáng)。這是由于網(wǎng)絡(luò)中各類群間的聯(lián)系是有限的，模塊結(jié)構(gòu)能夠維持其內(nèi)部微生物類群豐度波動(dòng)的影響不擴(kuò)散到其他模塊［40］。

通過(guò)探究各模塊的相對(duì)豐度與環(huán)境因子間的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，植物群落特性對(duì)真菌模塊的相對(duì)豐度的影響較小，影響各模塊豐度的主要因素仍為土壤性質(zhì)。與環(huán)境因子對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果相同，土壤全磷和全鉀對(duì)模塊的相對(duì)豐度影響更強(qiáng)。尹亞麗等［41］研究表明土壤全鉀對(duì)真菌群落的影響并不顯著；與之不同的是本研究將真菌群落進(jìn)行類群劃分發(fā)現(xiàn)，模塊1與土壤全鉀呈極顯著正相關(guān)，而其他3個(gè)模塊與土壤全鉀呈負(fù)相關(guān)。其可能的原因是模塊1真菌的主要營(yíng)養(yǎng)方式為營(yíng)腐生，其他類群的腐生菌類群豐度降低，Peng等［42］研究幾種腐生菌發(fā)現(xiàn)，鉀離子通過(guò)定殖在植物上的真菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)。不同于Xu等［43］得到的土壤速效磷與微生物量磷呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果，本試驗(yàn)真菌模塊對(duì)土壤磷的響應(yīng)大不相同，模塊1與土壤全磷顯著正相關(guān)，模塊2與全磷顯著負(fù)相關(guān)，這是因?yàn)橥寥廊讓?duì)真菌的影響是通過(guò)與其共生的植物實(shí)現(xiàn)的［19］。但由于不同放牧強(qiáng)度間土壤全磷差異不顯著，土壤真菌模塊1與模塊2對(duì)不同放牧強(qiáng)度的響應(yīng)也不顯著。本研究的模塊1與模塊2是構(gòu)成真菌群落的主要類群，二者相對(duì)豐度對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)是相反的，造成這一結(jié)果的可能原因是同一模塊占據(jù)相同的生態(tài)位，親緣關(guān)系相近的真菌利用相同的底物，功能也趨于一致。放牧活動(dòng)對(duì)土壤容重有直接的影響，以往的研究表明土壤容重可以通過(guò)影響土壤孔隙度和土壤溫濕度進(jìn)而改變微生物的群落，使微生物群落與土壤容重呈負(fù)相關(guān)［44］。土壤容重變小使其孔隙度增大［45］，真菌擁有活躍的菌絲，能夠隨環(huán)境的變化與刺激改變其形態(tài)［46］，土壤容重變小為真菌菌絲的生長(zhǎng)提供了空間。本研究?jī)H有模塊3的相對(duì)豐度與土壤物理性質(zhì)存在顯著相關(guān)關(guān)系，并且模塊3與堿解氮、速效磷等速效養(yǎng)分呈正相關(guān)，其可能的原因是該類群的組成單一，對(duì)環(huán)境因子敏感［47］；模塊4的真菌相對(duì)豐度最小，但其組成分類更豐富，模塊3與模塊4的組成與結(jié)構(gòu)差異及其對(duì)不同放牧強(qiáng)度的響應(yīng)表明，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的真菌模塊具有更高的模塊內(nèi)關(guān)聯(lián)復(fù)雜性，因而對(duì)環(huán)境變化具有更強(qiáng)的抵抗力，但這與Wagg等［38］得到的結(jié)果相反。

4 結(jié)論

短期放牧處理可增加土壤真菌群落的多樣性與豐富度，但空間異質(zhì)性與放牧歷時(shí)較短使得不同放牧強(qiáng)度的真菌群落結(jié)構(gòu)差異不顯著。土壤因子是不同放牧強(qiáng)度土壤真菌群落變化的主要驅(qū)動(dòng)因子，放牧處理通過(guò)牛糞返還增加土壤中的不穩(wěn)定碳和改變土壤孔隙兩個(gè)方面提高子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，競(jìng)爭(zhēng)排斥作用使放牧處理的擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度減少。通過(guò)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)模塊化分析將土壤真菌分為不同的模塊類群發(fā)現(xiàn)，真菌各物種間的相互作用使真菌群落構(gòu)成不同的模塊類群，但土壤因子仍是真菌相互作用類群變化的主要預(yù)測(cè)因子。