ACTN4、HPV16 E7檢測在食管癌患者診斷及預后判斷中的價值

王 力，邸 靜

商洛國際醫學中心醫院病理科，陜西商洛 726000

食管癌是一種發生在食管上皮的消化道惡性腫瘤，因病理類型的差異而有所不同，在我國發病率較高，僅次于胃癌，但食管癌的病因與發病機制迄今尚不明確。據統計，我國每年約有15萬人因食管癌而死亡，由于食管癌在早期癥狀較輕，除吞咽有哽噎感外無其他不適，因此多被患者所忽視，影響了治療時間，這也是造成食管癌病死率較高的原因之一[1]。食管是幽門螺桿菌感染的必經之路，也是與人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染有關的原因之一，近年來HPV與食管癌之間的關系逐漸被人們重視[2]。α-輔肌動蛋白4(ACTN4)作為血影蛋白超家族的成員，是一種膜相關骨架蛋白的肌動蛋白，可參與細胞骨架重組以及調節細胞黏附及形態，通過與肌動蛋白相結合保持細胞骨架完整性和調節細胞運動[3]。相關研究發現，ACTN4與多種腫瘤的發生、發展及侵襲轉移密切相關，且ACTN4表達降低后可顯著抑制包括口腔鱗狀細胞、腦膠質瘤細胞、星形細胞瘤細胞在內的多種腫瘤的活性[4]。但目前對ACTN4在食管癌發生發展中所起的作用以及與臨床指標的相關性方面還少有證實。本研究通過免疫組化檢測HPV16 E7、ACTN4在食管癌組織中的表達，并分析其與食管癌患者臨床病理特征和術后生存期的關系，旨在為HPV16 E7、ACTN4在食管癌發生、發展中的作用以及食管癌的診斷提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年5月在本院進行食管癌手術治療的80例患者為研究對象，食管癌病理組織及癌旁2 cm正常組織均保存于本院病理科。納入標準：接受手術治療的原發性食管癌，初次手術，術前未接受全身治療。排除標準：無明確病理診斷，化學療法治療者，語言障礙及存在精神障礙者，客觀或主觀原因退出者。所有患者中位年齡55歲，<55歲和≥55歲患者分別為36例和44例；腫瘤最大徑≤3 cm及>3 cm的分別為46例、34例；病理分級Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級分別為26例、35例和19例；淋巴結轉移為43例，未轉移為37例，本研究已取得患者同意，且不違背本院倫理規定。

1.2儀器與試劑 HPV16 E7、ACTN4單克隆抗體(美國Abcam公司)，SP9002免疫組化試劑(中國上海鼎杰生物有限公司)；蘇木青染色體(中國南京建成生物有限公司)。

1.3方法 常規10%甲醛固定，石蠟包埋，連續4 μm切片，采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)處理過的載玻片行免疫組化。

1.4免疫組織化學染色檢測HPV16 E7、ACTN4表達 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，切片常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復1 min，30 mL/L過氧化氫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液3 min×5次，HPV16 E7、ACTN4一抗(1∶200)5 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液3 min×5次，加入聚合物增強劑，35 ℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液3 min×5次，加入酶標抗兔聚合物放大劑，常溫孵育15 min，磷酸鹽緩沖液清洗，蘇木精復染5 min，2%鹽酸乙醇分化10 s，自來水返藍15 min，切片自然風干，中性樹膠封片，DAB顯色后蘇木素復染，顯微鏡下觀察拍照。

1.5統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統計學處理。計數資料以頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析診斷價值。聯合診斷采用Logistic回歸模型構得到新預測變量用于食管癌的診斷。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1食管癌組織和癌旁組織中HPV16 E7、ACTN4表達情況 HPV16 E7陽性的組織標本中，細胞膜和細胞質呈黃棕色。食管癌組織的HPV16 E7陽性表達率為70.00%(56/80)，癌旁正常組織的HPV16 E7陽性表達率為17.50%(14/80)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=50.40，P<0.001)。ACTN4陽性的組織標本中，細胞質和細胞膜呈淡黃色，食管癌組織的ACTN4陽性表達率為65.00%(52/80)，癌旁組織的ACTN4陽性表達率為22.50%(18/80)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=33.03，P<0.001)。

2.2食管癌HPV、ACTN4表達與臨床病理特征分析 HPV16 E7陽性表達與食管癌患者年齡、腫瘤最大徑、腫瘤類型無關(P>0.05)，而與病理分級、淋巴結轉移、N分期、M分期有關(P<0.05)；ACTN4陽性表達與食管癌患者年齡、腫瘤最大徑、腫瘤類型無關(P>0.05)，而與病理分級、淋巴結轉移、N分期、M分期有關(P<0.05)。見表1。

表1 食管癌HPV16 E7、ACTN4表達與臨床病理特征分析

2.3HPV16 E7、ACTN4檢測用于食管癌診斷的價值 繪制HPV16 E7、ACTN4單獨及聯合檢測用于食管癌診斷的ROC曲線：HPV16 E7檢測的靈敏度為81.30%，特異度為80.70%，曲線下面積(AUC)為0.768；ACTN4檢測的靈敏度為74.2%，特異度為76.5%，AUC為0.713；HPV16 E7、ACTN4聯合檢測的靈敏度為90.60%，特異度為86.20%，AUC為0.825。見圖1。

圖1 HPV16 E7、ACTN4單獨及聯合檢測用于食管癌診斷的ROC曲線

2.4HPV16 E7、ACTN4表達與食管癌患者預后的關系分析 HPV16 E7陽性食管癌患者2年生存率為44.64%(25/56)，HPV16 E7陰性患者2年生存率為70.83%(17/24)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。ACTN4陽性食管癌患者2年生存率為42.30%(22/52)，ACTN4陰性食管癌患者2年生存率為71.42%(20/28)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 HPV16 E7表達與食管癌患者預后的關系分析

圖3 ACTN4表達與食管癌患者預后的關系分析

3 討 論

近年來外科手術在食管癌領域的應用已經取得了明顯的進步，但食管癌患者術后生存率以及生活質量方面仍受多種因素影響[5]。因此，深入了解與食管癌發生、發展相關的潛在分子機制，找尋與食管癌預后相關的分子靶點，為日后食管癌等疾病的研究提供有力證據非常必要。流行病學和生物學證據表明，HPV16 E7與食管癌的發生有關，而且食管癌患者HPV的感染率為50%～70%，這也是晚期食管癌患者存活率較低的原因之一[6]。ACTN4作為一種肌動蛋白，可增加腫瘤細胞的活性，并同腫瘤的轉移與不良預后密切相關，有研究表示，ACTN4在多種癌癥中呈高表達，并在多數癌癥中有促進癌細胞增殖的作用，因此研究ACTN4、HPV16 E7在食管癌組織中的表達及其與患者臨床病理特征和生存預后的關系尤為重要[7]。

有研究報道食管鱗癌中有ACTN4、HPV16 E7等致癌因子[7]。國內外均有在食管癌組織中檢出ACTN4、HPV16 E7等癌基因的報道，證實其致癌率為64%～67%，并認為ACTN4、HPV16 E7升高與食管癌的發生密切相關[8]。本研究的免疫組織化法檢測結果顯示，食管癌組織中HPV16 E7表達陽性率為70.00%，在癌旁組織中表達為17.50%，ACTN4在食管癌組織陽性表達為65.00%，癌旁正常組織表達為22.50%，表示HPV16 E7、ACTN4均在食管癌中呈高表達，促進疾病發生、發展。在食管癌組織中，對癌細胞增殖起促進作用的ACTN4促癌因子的表達上調會導致癌細胞的異常分化。HPV16 E7抑制MET、EGF等促凋亡因子的表達下調，會使上皮細胞角化并分化多種相關的中間纖維成分，這些改變構成了食管癌細胞特異性的表達，促進了食管癌疾病的發生發展[9]。MENG等[8]研究表明，在癌細胞內，ACTN4可以通過結合轉錄因子核因子-κB(NF-κB)等產生調控壓力進而刺激腫瘤細胞的增殖，增加癌細胞活性，促進食管癌發展。食管癌的致癌機制還可能包括HPV中的E6、E7蛋白誘導的致癌因子。有研究表明，HPV18、16、E7可與E6協同作用，致使人類上皮細胞永生化并導致相應細胞因子產生紊亂，對癌細胞的惡性轉化產生促進作用[10]。在食管癌臨床病理特征中HPV16 E7與ACTN4的陽性表達在癌癥的發生、發展中具有重要的促進作用。本研究結果表明，HPV16 E7陽性、ACTN4陽性與患者年齡、腫瘤最大徑、腫瘤類型無關，而與病理分級、淋巴結轉移有關。有研究發現，影響食管癌切除術后患者生存率的主要因素是腫瘤的浸潤深度和淋巴結轉移狀況，ACTN4、HPV16 E7陽性表達與細胞癌患者產生的淋巴轉移情況呈正相關，ACTN4、HPV可能通過參與細胞轉移過程進而促進腫瘤的進展，促進食管癌的淋巴結轉移[11]。其潛在機制可能為ACTN4通過與鳥苷激酶聯合而調控細胞骨架的組織和黏著，進而影響細胞的活動力和腫瘤轉移，食管癌中過表達的ACTN4可刺激食管癌細胞產生侵襲性的細胞突起，使其表現出更強的惡性表型，而HPV則主要憑借病毒癌基因在細胞轉化中發揮作用，在已轉化的癌細胞中HPV16 E7基因組通常以缺失性方式整合在癌細胞中，并通過引起其他癌基因的異常活動而發揮致癌作用，進而促進食管癌等疾病的發生、發展[12-13]。

本研究結果顯示，HPV16 E7陽性食管癌患者的2年生存率為44.64%(25/56)，HPV16 E7陰性食管癌患者的2年生存率為70.83%(17/24)，ACTN4陽性食管癌患者2年生存率為42.30%(22/52)，ACTN4陰性食管癌患者的2年生存率為71.42%(20/28)，提示ACTN4、HPV16 E7可能參與食管癌病程的進展，并對食管癌患者術后的生存期具有一定影響。在食管癌中HPV16是導致正常細胞不穩定性的關鍵因素，HPV16 E7通過調控相關傳導通路進而縮短癌細胞周期，促進癌細胞大量分裂增殖，引起端粒酶等致癌物質的活性增加，使癌細胞分裂增殖失控和癌細胞壽命延長[14]。相關研究表明，ACTN4在人類表皮癌、膀胱癌、胃癌及卵巢癌細胞中均呈高表達，食管癌中ACTN4可通過與Rho家族分子聯合，影響正常細胞的活動力和腫瘤轉移，進而調控癌細胞組織黏著和癌癥的發展[15]。HPV16被認為是候選的癌基因，HPV16 E7的陽性表達越高越能夠促進癌癥的侵襲和轉移，并與膀胱癌、卵巢癌等多種疾病患者的不良預后有著緊密聯系，提示HPV16 E7可能位于細胞癌變所經過的共同通路上，且能夠普遍參與腫瘤的發生發展[16]。

綜上所述，HPV16 E7、ACTN4均在食管癌中呈高表達，并且與病理分級、組織分期和淋巴結轉移有關，并能夠直接影響食管癌患者預后，可以作為食管癌臨床診斷中的重要依據。