Sysmex XN-9000全自動血液分析流水線復(fù)檢規(guī)則的評估和驗證*

鄭雅斌，唐文佳，陳小倩，周 琰，周佳燁，張春燕△，潘柏申，王蓓麗，郭 瑋

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建廈門 361015；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032

血細(xì)胞分析是臨床最常用的檢測項目之一，為疾病診療、健康咨詢和科學(xué)研究提供依據(jù)。隨著全自動血液分析儀功能的改進(jìn)，其檢測結(jié)果越發(fā)準(zhǔn)確的同時還能向?qū)嶒炇姨峁└嘌?xì)胞分析參數(shù)。而流水線的應(yīng)用更是實現(xiàn)了自動復(fù)檢和涂片，提高了檢測速度，節(jié)約了人力成本。盡管如此，異常的血細(xì)胞形態(tài)和某些特定的疾病仍然需要人工鏡檢予以復(fù)查和驗證，以免造成誤診和漏診，影響患者的診斷和治療。結(jié)合于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院就診患者以14歲以上人群為主且腫瘤患者較多的情況及儀器特點，參考國際血液學(xué)復(fù)檢專家組推薦的41條復(fù)檢規(guī)則，醫(yī)院檢驗科制訂了相應(yīng)的復(fù)檢規(guī)則，現(xiàn)對該規(guī)則進(jìn)行驗證。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來源 隨機(jī)選取復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院2021年6月7日至2021年6月11日的684例擬行血常規(guī)檢測的標(biāo)本。其中門/急診患者標(biāo)本265例，住院患者標(biāo)本282例，體檢患者137例。所有的標(biāo)本均放置于室溫保存，4 h內(nèi)完成血常規(guī)檢測，檢測前觀測標(biāo)本性狀，剔除有溶血、黃疸、乳糜、凝集等情況的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 Sysmex XN-9000型全自動血液分析流水線的組成：1個XN-10(B4)模塊、2個XN-20(A1)模塊和1臺SP-10全自動推片機(jī)及1臺DI 60閱片機(jī)。采用Sysmex公司的配套試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。顯微鏡為Olympus CX31型光學(xué)顯微鏡。EDTA-K2真空采血管為BD公司產(chǎn)品。瑞吉氏染液為珠海貝索公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1儀器檢測 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院實驗室參考國際血液學(xué)復(fù)檢專家組的意見[1]結(jié)合醫(yī)院特點制訂儀器復(fù)檢規(guī)則，見表1。所有標(biāo)本按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程檢測，根據(jù)設(shè)定的規(guī)則進(jìn)行復(fù)測和鏡檢。鏡檢規(guī)則驗證中，儀器結(jié)果只要符合復(fù)檢要求“涂片鏡檢”中的任何一條即為儀器陽性。

表1 Sysmex XN-9000全自動血液分析流水線復(fù)檢規(guī)則

續(xù)表1 Sysmex XN-9000全自動血液分析流水線復(fù)檢規(guī)則

1.4人工鏡檢

1.4.1所有的標(biāo)本采用Sysmex SP-10全自動推片機(jī)制備血涂片并染色，由兩名有資質(zhì)的工作人員雙盲鏡檢，每張片觀察2×200個細(xì)胞，若結(jié)果差異大于Rümke表中的標(biāo)準(zhǔn)，由第3名工作人員鏡檢，取沒有差異的兩份結(jié)果均值。

1.4.2人工鏡檢判斷標(biāo)準(zhǔn)參照國內(nèi)血涂片陽性標(biāo)準(zhǔn)(2008年中國血細(xì)胞分析復(fù)審協(xié)作組制定的標(biāo)準(zhǔn))：(1)紅細(xì)胞明顯大小不等(細(xì)胞大小相差1倍以上)，染色異常紅細(xì)胞>30%(淡染區(qū)>1/2)；(2)巨大血小板>15%；(3)見到PLT聚集；(4)存在D?hle小體細(xì)胞；(5)中毒顆粒中性粒細(xì)胞>10%；(6)空泡變性粒細(xì)胞>10%；(7)原始細(xì)胞>1%；(8)早幼/中幼粒細(xì)胞>1%；(9)晚幼粒細(xì)胞>2%；(10)反應(yīng)性淋巴細(xì)胞>5%；(11)有核紅細(xì)胞>1%；(12)漿細(xì)胞>1%。鏡檢結(jié)果只要觸及12條鏡檢規(guī)則中任何一條即為人工鏡檢陽性。

1.5復(fù)檢規(guī)則驗證標(biāo)準(zhǔn) 以人工鏡檢為金標(biāo)準(zhǔn)。儀器結(jié)果與人工鏡檢均陽性為真陽性；儀器結(jié)果與人工鏡檢均陰性為真陰性；儀器結(jié)果陽性，而鏡檢結(jié)果陰性為假陽性；儀器結(jié)果陰性，而鏡檢結(jié)果陽性為假陰性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：假陰性率<5%，且白血病細(xì)胞無漏診。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 真陽性率、假陰性率、假陽性率、真陰性率的計算參照文獻(xiàn)[2]。采用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，受試者工作特征(ROC)曲線分析儀器檢測紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的特異度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Cohen’s Kappa分析評估人工鏡檢與儀器結(jié)果的一致性，以P<0.001為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

“Rerun”率為3.9%(27/684)，”Reflex”率為7.6%(52/684)，鏡檢率為21.5%(147/684)，見表2。以人工鏡檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，與儀器結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果為真陽性率12.3%(84/684)，假陰性率2.5%(17/684)，假陽性率9.2%(63/684)，真陰性率76.0%(520/684)，假陰性率低于國際血液學(xué)復(fù)檢專家組確定的5%，無白血病細(xì)胞漏檢。

表2 Sysmex XN-9000全自動血液分析流水線復(fù)檢情況(n=684)

本次驗證結(jié)果中，2例標(biāo)本因人工鏡檢幼稚粒細(xì)胞陽性但未觸及儀器推片規(guī)則而導(dǎo)致假陰性；16例標(biāo)本因“紅細(xì)胞明顯大小不等”或伴有“染色異常紅細(xì)胞>30%”人工鏡檢陽性但儀器規(guī)則未設(shè)置而導(dǎo)致假陰性，其中1例既有粒細(xì)胞陽性又涉及紅細(xì)胞鏡檢陽性，共17例假陰性的標(biāo)本。684例標(biāo)本中，涉及“紅細(xì)胞明顯大小不等”的標(biāo)本有64例，“染色異常紅細(xì)胞>30%”的標(biāo)本有53例，以人工鏡檢結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)對紅細(xì)胞儀器檢測參數(shù)進(jìn)行ROC曲線分析，見圖1、2，表3。當(dāng)紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)的cut-off值為16%時，ROC曲線下面積0.98(P<0.05)，靈敏度92.2%，特異度95.5%，通過Cohen’s Kappa分析，Kappa值為0.76，95%CI為0.681～0.829(P<0.001)，儀器法和鏡檢法高度一致，一致率為95.18%。以人工鏡檢“染色異常紅細(xì)胞>30%”為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制與儀器法紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、血細(xì)胞比容(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)的ROC曲線，曲線下面積分別為0.49、0.85、0.78、0.91、0.92、0.89，除了RBC(P>0.05)外，其余各項參數(shù)均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以MCH的cut-off值為25 pg時，ROC曲線下面積0.92(P<0.05)，靈敏度73.6%，特異度98.7%，Kappa值為0.76，95%CI為0.688～0.838(P<0.001)，鏡檢法淡染區(qū)擴(kuò)大與儀器MCH結(jié)果高度一致，一致率為96.78%。

圖1 RDW評價“紅細(xì)胞明顯大小不等”的ROC曲線

圖2 RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC評價“染色異常紅細(xì)胞>30%”的ROC曲線

表3 Cohen’s Kappa一致性分析

3 討 論

假陰性標(biāo)本中，16例標(biāo)本因“紅細(xì)胞明顯大小不等”或伴有“染色異常紅細(xì)胞>30%”而人工鏡檢陽性，但儀器推片規(guī)則未涉及，由此可見未設(shè)置紅細(xì)胞異常相關(guān)復(fù)檢規(guī)則是導(dǎo)致假陰性最主要的原因。中華醫(yī)學(xué)會提出的《血細(xì)胞分析報告規(guī)范化指南》中提到對于紅細(xì)胞大小、染色性和均一性等異常的結(jié)果可通過儀器檢測所得MCV、MCH、MCHC和RDW等參數(shù)進(jìn)行反映[2]，人工鏡檢這些紅細(xì)胞相關(guān)信息，可能受到個人經(jīng)驗因素影響，其靈敏度和一致性不如血細(xì)胞分析儀檢測結(jié)果的準(zhǔn)確和穩(wěn)定[3]。ICSH推薦使用RDW作為衡量紅細(xì)胞大小變化程度的指標(biāo)，建議采用參數(shù)MCH來衡量紅細(xì)胞低色性程度。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，RDW對“紅細(xì)胞明顯大小不等”有判斷意義；紅細(xì)胞各項參數(shù)中MCH的曲線下面積最大，與“染色異常紅細(xì)胞>30%”的相關(guān)性最高，全自動血液分析儀的結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以本次鏡檢規(guī)則驗證所用5個工作日內(nèi)所有的標(biāo)本為例，若增加國際血液學(xué)復(fù)檢專家組推薦的紅細(xì)胞相關(guān)鏡檢規(guī)則“MCV<75 fL”“MCV>105 fL”“RDW>22 fL”和“雙峰紅細(xì)胞”，則鏡檢率增加3.38%，無疑降低了檢測效率。因而，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院實驗室暫不增加紅細(xì)胞異常相關(guān)的鏡檢規(guī)則，但審核報告中若發(fā)現(xiàn)異常數(shù)據(jù)或報警提示，應(yīng)進(jìn)行鏡檢復(fù)核并注意異常的形態(tài)[2]，在有臨床意義時必須報告，報告內(nèi)容需要考慮到結(jié)果與臨床的相關(guān)性[4]。近年來許多組織發(fā)布的關(guān)于血細(xì)胞分析報告的建議，均旨在使檢驗科的工作重點從過去單純的提供準(zhǔn)確的檢測數(shù)值轉(zhuǎn)向為臨床提供能反映外周血異常情況的有意義信息。

考慮到復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院患者的特點，本研究將“幼稚粒細(xì)胞>3%”設(shè)置為“幼稚粒細(xì)胞”推片報警信息。2例幼稚粒細(xì)胞假陰性的標(biāo)本幼稚粒細(xì)胞分別為2.6%和2.1%，均來自抗腫瘤治療過程中的腫瘤患者，2病例人工鏡檢計數(shù)分別得到1.5%中幼粒細(xì)胞和2.5%晚幼粒細(xì)胞，假陰性結(jié)果未對診療造成影響。但若將Sysmex公司推薦的幼稚粒細(xì)胞>2%設(shè)置為鏡檢規(guī)則，則推片率增加1.1%，假陽性率增加1.3%。本次鏡檢結(jié)果驗證得到的白細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果與大多數(shù)文獻(xiàn)得出的結(jié)論一致，除了嗜堿性粒細(xì)胞外，其余結(jié)果相關(guān)性較好，對異常細(xì)胞的報警靈敏度和特異度較高[5-7]，雖然幼稚粒細(xì)胞僅能檢出各階段幼粒細(xì)胞，對其他異常細(xì)胞不敏感，但結(jié)果與流式儀器法檢測結(jié)果具有較好的相關(guān)性[8]，審核血細(xì)胞分析報告時，還應(yīng)多結(jié)合臨床相關(guān)情況對結(jié)果進(jìn)行分析。

Sysmex XN系列血細(xì)胞分析儀改良了“Reflex”復(fù)檢通道的系統(tǒng)和試劑，例如PLT-F通道提高了低值血小板結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性[6，9-10]；WPC通道可以鑒別原始細(xì)胞和異常淋巴細(xì)胞，從而減少了復(fù)檢率[5，11]；WNR通道有核紅細(xì)胞的檢測結(jié)果與鏡檢法的一致性較好，與流式細(xì)胞儀法也呈相關(guān)性[5，12-13]。較高的檢測性能提高了推片報警信息的準(zhǔn)確度。本次復(fù)檢規(guī)則驗證只選取了684份標(biāo)本，以血液科患者和腫瘤患者居多，這類患者外周血象的異常比例更高，標(biāo)本復(fù)檢率高于常規(guī)患者，便于對鏡檢規(guī)則進(jìn)行評估和驗證，但這使本研究中的驗證存在一定的局限性。在此后的工作中還會持續(xù)關(guān)注紅細(xì)胞異常的鏡檢等問題，不斷地調(diào)整和優(yōu)化復(fù)檢規(guī)則以滿足臨床工作的需求，提高血細(xì)胞分析報告的質(zhì)量。