化妝品中人表皮生長因子的UPLC-Q-TOF-MS測定方法和量化確證策略*

吳 震，歐陽淑娟，伍英英，方繼輝

(國家藥監(jiān)局化妝品風險評估重點實驗室,廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663)

為有效識別和防控化妝品中非法使用人表皮生長因子(EGF)的風險，前文《酶聯(lián)免疫法快速篩查化妝品中非法使用人表皮生長因子》和《高效液相色譜法測定化妝品中非法使用人表皮生長因子》介紹了先采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法快速篩查出疑似樣品，再用高效液相色譜(HPLC)方法定量和確證的策略[1-2]。利用超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)方法高效、精確的特點，以及與ELISA方法原理互補，在HPLC方法上又有擴展提高的優(yōu)勢，本工作建立了化妝品經(jīng)提取過濾，用UPLC分離，使用ESI正離子多反應模式檢測，外標法定量的測定方法。

隨著分析技術(shù)的發(fā)展，目標可能被多個不同方法分析，受不同誤差影響，其結(jié)果未必一致；從實際合理性出發(fā)，對目標的分析也不可能是無休止和絕對的，這導致實際分析中需要可操作性的確證策略[3]。歐洲食用動物獸藥殘留監(jiān)管機構(gòu)曾提出了一個基于質(zhì)譜技術(shù)識別分值的定性確證策略[4-5]，為食品領(lǐng)域獸藥殘留的確證提供了非強制性解決方案。在此基礎(chǔ)上，本工作根據(jù)化妝品中生物制品分析的需求和實際情況，提出了一種化妝品中EGF檢測的綜合量化確證策略：聯(lián)用原理上互不干擾的數(shù)種檢測方法，在符合一定要求的前提下，根據(jù)目標和檢測特征分別賦予分值，依據(jù)總分值對結(jié)果進行不同程度的肯定。

類似的方法和確證策略國內(nèi)尚未見報道，也沒有相關(guān)標準和法定方法出臺。化妝品中EGF的快速篩查、測定和確證策略體系的建立，將為識別、評估和防控化妝品中非法使用EGF的安全風險提供有力的科學監(jiān)管工具和技術(shù)支持。量化確證策略的提出，為化妝品中物質(zhì)的確證提供了一個參考解決方案。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

BSA，生物試劑，使用前先確認對EGF檢測無干擾；氯化鈉(分析純)，廣試；乙腈、甲酸，質(zhì)譜純，CNW；一級實驗用水；0.4%(w/w)的BSA氯化鈉溶液：取0.4 g的BSA加氯化鈉30 g加水100 mL溶解經(jīng)濾膜過濾；對照品：重組人表皮生長因子GMP-105-04(批號EGMP10504062，含量98.82%)，上海普欣；陽性對照樣品：外用重組人表皮生長因子(批號20180826-2)，上海昊海生物；重組人表皮因子滴眼液(批號201908089C)，桂林華諾威基因。

UPLC-Q-TOF-MS儀(1290+6450+ESI)，美國Agilent公司；XS205DU分析天平，瑞士METTLER公司；5810R高速冷凍離心機，美國Eppendorf公司；濾膜:0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)，津騰公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；渦旋混合器，德國IKA 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACULTY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：25 ℃；樣品盤：4 ℃避光；進樣量：20 μL；流動相流速：0.25 mL/min；流動相：A為0.1%(w/w)甲酸溶液，B為0.1%(w/w)甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；采集：分段采集；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：8 L/min；霧化氣壓力：40 psig；毛細管電壓：4000 V；Fragmentor電壓：175 V；Skimmer電壓：65 V；八極桿射頻電壓：750 V；正離子多反應監(jiān)測模式；碰撞能：3.7*(離子質(zhì)荷比)/100+2.5；選擇離子質(zhì)荷比1036.9584；電荷數(shù)6。EGF的特征離子參數(shù)見表2。特征母離子同位素相對豐度及子離子相對豐度的最大允許偏差見表3。

表2 EGF特征離子參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters of EGF

表3 離子相對豐度的最大允許偏差Table 3 Maximum permission deviation of ion relative abundance

1.3 樣品處理

凍干粉：稱取均勻的凍干粉樣品20 mg，加入1 mL的0.2%(w/w) BSA溶液溶解，用0.22 μm的PTFE濾膜過濾，得試樣溶液，必要時稀釋。水劑：稱取水劑樣品0.5 g，加入0.4%(w/w) BSA氯化鈉溶液至1 mL，振搖混勻，用0.22 μm的PTFE濾膜過濾，得試樣溶液，必要時稀釋。啫喱：稱取啫喱樣品0.5 g，加入0.4%(w/w) BSA氯化鈉溶液至1 mL，振搖混勻，必要時以4000 r/min離心15 min，取水層用0.22 μm的PTFE濾膜過濾，得試樣溶液，必要時稀釋。

1.4 系列加標標準溶液配制

將對照品用水溶解配制成1 g/L質(zhì)量濃度的對照品儲備溶液。選取5份與待測化妝品性質(zhì)盡可能相似的均勻不含EGF的化妝品作為空白基質(zhì)，分別加入適量對照品儲備溶液，按樣品處理方法進行處理，得到為EGF質(zhì)量濃度為0.5 μg /mL、1 μg /mL、2 μg /mL、5 μg /mL、10 μg /mL且BSA濃度恒定為0.2%(w/w)的系列濃度加標標準溶液。加標標準溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，4 ℃避光保存。

1.5 方法學考察

1.5.1 空白實驗

分別取0.2%(w/w) BSA溶液、0.4%(w/w) BSA氯化鈉溶液和不同化妝品劑型的空白基質(zhì)試樣溶液按條件進行檢測，檢查干擾情況。

1.5.2 檢出限和定量下限

將不同濃度含EGF的加標標準溶液按條件進行檢測，檢查特征峰面積信噪比應分別大于3和10。

1.5.3 線性范圍

將系列加標標準溶液進行檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標，以特征離子峰面積為縱坐標進行線性擬合。

1.5.4 重復性

選取定量下限濃度，2倍定量下限濃度和加標標準溶液最高濃度，不同劑型化妝品加標標準溶液一日內(nèi)重復檢測6次，考察特征峰面積變化。

1.5.5 回收率

選取定量下限濃度，2倍定量下限濃度和加標標準溶液最高濃度，不同劑型化妝品中加入EGF對照品的重復實驗6次，考察相對加標標準溶液的回收百分率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

EGF在UPLC-Q-TOF-MS儀器中經(jīng)ESI源后的離子以多種電荷存在。通過特征離子豐度對比，發(fā)現(xiàn)當電荷數(shù)z=6時，特征母離子的豐度最高。通過回溯EGF的結(jié)構(gòu)，理論計算得到的精確質(zhì)荷比(m/z=1036.9584)與實際儀器經(jīng)校準后檢測得到的結(jié)果相對誤差小于百萬分之五，證實了對照品和檢測方法是有效的。

EGF在溶液環(huán)境中不太穩(wěn)定，且在UPLC-Q-TOF-MS儀器中吸附現(xiàn)象非常嚴重，極大地干擾結(jié)果。經(jīng)對比研究后，選擇使用固定高濃度的BSA溶液作為提取劑可以較好地使EGF保持穩(wěn)定且可得到可信的檢測結(jié)果。這可能因為EGF與BSA結(jié)構(gòu)相似，存在競爭吸附現(xiàn)象。高濃度的BSA可以相對極大抑制EGF的吸附，同時如果BSA在實驗過程中保持濃度相對一致，可以使EGF的吸附處于相對穩(wěn)定水平，從而不影響實驗結(jié)果。

三家不同實驗室分別使用了美國Agilent公司1260、1290液相色譜儀，美國Aglient公司6450和美國Thermo公司 QE 四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，ACULTY UPLC BEH C18(1.7 μm， 2.1 mm×100 mm)、Thermo Hypersil GOLD(1.9 μm，2.1 mm×50 mm)， X-Bridge C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱按本方法進行了測試和驗證，過程中進行了400余次檢測，結(jié)果證明本方法耐用性良好。

2.2 方法學考察結(jié)果

2.2.1 空白實驗

不同劑型化妝品空白基質(zhì)中EGF的提取色譜圖均無干擾。加標標準溶液的特征母離子質(zhì)譜圖、選擇特征母離子色譜圖和選擇特征子離子質(zhì)譜圖分別如圖1、圖2和圖3所示。

圖1 EGF母離子質(zhì)譜Fig.1 Mass spectrum of EGF parent ion

圖2 EGF選擇離子色譜Fig.2 Chromatography of EGF selected ion

圖3 EGF選擇子離子質(zhì)譜Fig.3 Mass spectrum of EGF selected daughter ion

2.2.2 檢出限和定量下限

本實驗室得到檢出限為0.2 μg/mL，按凍干粉取樣量 20 mg計，檢出質(zhì)量濃度為10 μg/g，定量下限質(zhì)量濃度為25 μg/g；如以水劑或啫喱取樣量0.5 g計，檢出質(zhì)量濃度為0.4 μg/g，定量質(zhì)量下限為1 μg/g。

2.2.3 線性和線性范圍

本實驗室在0.5～10 μg/mL內(nèi)EGF濃度與特征峰面積線性關(guān)系良好，R2大于0.9967，如表4所示。結(jié)果的線性關(guān)系比HPLC-DAD結(jié)果的線性稍差，這是受Q-TOF-MS的原理制約和基質(zhì)效應影響導致的。

表4 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear regression equations and sqaredcorrelation coefficients

2.2.4 重復性

本實驗室在線性范圍內(nèi)3個不同濃度條件下重復性基本良好，凍干粉的低、中濃度，啫喱的中、高濃度的重復性受基質(zhì)效應一定影響，如表5所示。結(jié)果的重復性比HPLC-DAD結(jié)果的重復性稍差表明質(zhì)譜方法更容易受到基質(zhì)效應的影響。通過對重復性、線性和穩(wěn)定性等數(shù)據(jù)的分析，為減小基質(zhì)效應對結(jié)果的影響，研究最后選擇使用了空白基質(zhì)加標標準溶液。

表5 精密度結(jié)果Table 5 Results of test for precision

2.2.5 回收率

本實驗室在線性范圍內(nèi)3個不同濃度條件下回收率良好，回收率96.6%～116.6%，RSD小于5.0%，如表6所示。

表6 回收率結(jié)果Table 6 Results of test for recovery

2.3 確證策略

在檢測結(jié)果的確證中，一般情況下會遇到多個方法相互間的關(guān)系，希望能用不同的方法互相印證，得到確定的結(jié)果。但多個檢測方法的結(jié)果未必一致，無論是粗暴地用“第一法”作為確證方法，還是簡單地用一個方法否定另一個方法都是不科學的。此時需要根據(jù)檢測方法的特征原理分析，制定一個科學、可操作性的確證策略。

本研究提出了一個量化的確證策略：對于不同檢測方法，將原理上互不干擾的檢測特征賦予不同分值(重復的特征不重復計分)，在符合一定質(zhì)量要求前提下，用總分值對結(jié)果進行不同程度的肯定判斷。量化確證策略允許根據(jù)實際條件對檢測方法靈活選擇和不同組合，也允許根據(jù)檢測技術(shù)的發(fā)展，在更多、更新方法出現(xiàn)時進行擴展。

化妝品EGF的眾多檢測方法中，ELISA過程雖然涉及到抗原抗體反應、催化分解、顯色反應等多個步驟，但是最后具有可控質(zhì)量特征的僅為吸光度測量，所以賦1分。參考文獻2中使用到的免疫斑點法和免疫熒光法由于使用了同樣的抗原抗體反應原理，故同樣只賦1分，且相同原理不能重復計分(除非位點有適當?shù)牟町?。HPLC和UPLC的保留時間是同一原理的特征，保留時間是被測物質(zhì)在色譜柱中分配特性的可控質(zhì)量的特征，賦1分。由于DAD光譜可以是具有多個特征的連續(xù)的反映被測物質(zhì)光譜吸收的可控質(zhì)量的特征，相對于單波長紫外檢測可顯示更多特征，可以賦2分。質(zhì)譜的母離子質(zhì)量數(shù)是可以反映被測物質(zhì)的質(zhì)量的可控質(zhì)量的特征，相對與一般質(zhì)譜，高精度質(zhì)譜特征可以賦2分。如果被測物質(zhì)因同位素分布等原因存在多個特征母離子，為避免重復特征計分，需同時檢查同位素豐度特征，此時最多可以按兩個特征母離子特征計分；同理，為避免重復特征計分，對于高精度質(zhì)譜特征母離子的子離子可以賦3分，在檢查相對豐度特征情況下最多可以按兩個子離子特征計分。根據(jù)實際檢測結(jié)果的不同特征計算總分。考慮到EGF作為多肽類，具有結(jié)構(gòu)復雜，分子量大，重組生產(chǎn)過程復雜，不穩(wěn)定等特點，在確證策略中要求總分獲得1分及以上為篩查結(jié)果；獲得4分及以上為測定結(jié)果；獲得三種原理上互不干擾的檢測特征且總分6分及以上為確證結(jié)果。化妝品中EGF的確證策略如圖4所示，其中結(jié)果特征需符合表7的質(zhì)量要求。

圖4 化妝品中EGF檢測的量化確證策略Fig.4 Quantified determination strategy for EGF analysis in cosmetics

表7 檢測特征質(zhì)量要求Table 7 Quality requirements of analysis characteristics

2.4 樣品的測定和確證

按照實驗方法對源于網(wǎng)絡(luò)購買、國家化妝品監(jiān)督抽檢、廣東省化妝品風險監(jiān)測的共36個品種化妝品進行測定(其中凍干粉劑13個，水劑15個，啫喱劑8個)，并根據(jù)量化確證策略，對使用ELISA篩查方法、HPLC-DAD測定方法和UPLC-Q-TOF-MS測定方法檢測的結(jié)果進行確證，發(fā)現(xiàn)1批次標稱凍干粉化妝品原料和1批次標稱凍干粉化妝品中含有EGF，含量分別為26670 μg/g和46.5 μg/g。

3 結(jié) 論

建立了UPLC-Q-TOF-MS高效、精確測定凍干粉、水劑和啫喱劑化妝品中EGF的檢測方法。 提出了一個化學分析的量化確證策略，并用于化妝品中EGF的確證。為化妝品中EGF的風險管控和消費者的健康保護提供了技術(shù)支持，為化妝品中物質(zhì)的確證提供了一個新思路。