改性木質素磺酸鈉基竹葉黃酮納米膠體球的制備及防曬性能*

陳麗歡，谷炎培，張 英

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江省農產品加工技術研究重點實驗室，浙江省食品加工技術與裝備工程研究中心，浙江 杭州 310058)

人體長期或高劑量暴露于紫外輻射會導致如紅斑、燒傷、炎癥激活和皮膚癌等危害[1]。商業防曬產品分為物理防曬霜和化學防曬霜。物理防曬劑主要是氧化鋅和二氧化鈦，通過反射和散射來阻擋UV輻射，過程中產生ROS，具有細胞毒性、遺傳毒性。而化學防曬劑通常是與羰基結合的具有共軛基團的低分子量芳香族化合物，這種化學結構有利于π-π電子的躍遷，因此具有很強的紫外吸收作用，分為UVA和UVB類過濾器[2]。由于這些成分具有光穩定性和毒性，可破壞海洋生態系統[3]，同時長期使用易對人體產生副作用[4]。因此開發環保、廣譜、高效的防曬活性成分是目前研究的熱點。

竹葉黃酮(Bamboo-leaf flavone，BLF)是新型植物黃酮制劑，其主要功效成分為碳苷黃酮，包括四種特征性化合物：葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷[5]。竹葉黃酮在波長為240～290 nm(帶II)和300～350 nm(帶I)處有兩條吸收帶，具有清除自由基、抗衰老、抗輻射、紫外吸收等多重生物學功效[6]，已部分應用于保健食品和日化行業。但由于竹葉黃酮色澤深、精度低，限制了其在護膚品中的應用[7]。

木質素是自然界中唯一可直接提供芳環的可再生能源[8]，具有價格低廉、熱穩定性好、可降解等特點[9-10]。木質素含有酚、酮等紫外吸收基團，在防曬領域具有巨大應用潛力[11-16]。但由于工業木質素顏色較深、無規團聚、表面極性不均勻等缺點[15]，限制了其在高端護膚品中的應用。

為降低木質素色澤，Lee等[17]在溫和條件下使用二氧六環萃取分離得到淺色木質素(比約克曼木質素)，其紫外吸收效果并未減弱[18]，但由于高能耗、低生產率，比約克曼木質素難以大量生產；Zhang等[19]通過甲醇/水分餾和乙?；?，阻斷游離羥基，使木質素的亮度值(L值)提高313.5%，然而其紫外吸收能力大幅減弱。木質素作為天然的兩親聚合物，在適當體系中可通過非共價力自組裝形成膠束[15]，顯著增強其紫外防護效果[12，15，20-21]。但單一的木質素不足以達到預期的防曬效果。Qian等[22]認為木質素與商業防曬因子存在協同作用關系，極大增強其UV吸收率。

本文在前期研究基礎上，以高純度竹葉黃酮、改性木質素磺酸鈉和殼聚糖為原料，通過自組裝制得具有更淺色澤、更強生物學活性的復合納米膠體球。同時對改性木質素磺酸鈉基竹葉黃酮納米膠體球的觀、結構和防曬性能進行表征。以期在大幅度提升BLF70生物學活性和外觀色澤的同時，通過與木質素的協同作用，獲得天然、綠色、安全的新型復合防曬功能因子。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

竹葉黃酮(RP-HPLC 法測得其4個碳苷質量分數為75.7%，BLF70)，實驗室自提；木質素磺酸鈉(LS)，杭州通利源科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，國藥集團化學試劑有限公司；殼聚糖(CS)，美國麥克林公司；納米氧化鋅[含量>99.8%，(50±10) nm]、納米二氧化鈦(含量> 99.8%，40 nm)、BMDM(含量>98.0%)、OMC(含量>97.0%)，美國macklin公司；甲醇，色譜純，美國 sigma公司；乙醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；正己烷，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Centrifuge 5810 R型 超速冷凍離心機，德國eppendorf公司；Waters e 2695 高效液相色譜儀，美國 Waters 公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；CS-10彩譜色差儀，中國彩譜公司；Zetasizer Nano ZS90 納米粒度及Zeta電位分析儀，英國Malvern公司；Gemini SEM 300場發射掃描電子顯微鏡，德國Zeiss公司；Cary 60紫外可見光分光光度計，美國agilent公司； Nicolet IS 50 傅里葉變換紅外光譜計，美國Thermo公司；DSC1 差示掃描量熱儀，瑞士Mettler公司；UV 3600紫外分光光度計(帶積分球)，日本Shimadzu公司。

1.2 方 法

1.2.1 木質素磺酸鈉的改性與膠束化

參考Li[21]的方法，將60wt%的木質素磺酸鈉水溶液和50wt%的CTAB乙醇溶液按溶質質量比2.82∶1均勻混合，形成陰陽離子復合溶液；在攪拌條件下以1.2 mL/s的速率加入2000 mL水后靜置24 h，沉淀物冷凍干燥即得改性木質素磺酸鈉壁材(LS/CTAB)。

將無水乙醇-正己烷體系作為膠體球形成條件。稱取一定質量高純度竹葉黃酮(BLF70)和LS/CTAB溶于無水乙醇中，超聲溶解。在低速磁力攪拌的條件下，將正己烷通過恒流泵以一定速度滴入BLF70-LS/CTAB醇溶液中。繼續低速磁力攪拌10 min，得改性木質素磺酸鈉基竹葉黃酮納米膠體球混懸液(NSLS/BLF)。

在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗優化NSLS/BLF的制備工藝參數。以BLF70包封率為響應值，對LS/CTAB濃度(A)、LS/CTAB與BLF70質量比(B)、溶液體系中正己烷含量(C)、恒流泵流速(D)進行L16(44)正交實驗，因素配置水平如表1所示。

表1 正交試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2 NSLS/BLF的碳苷黃酮包埋效果評價

采用HPLC法測定NSLS/BLF對BLF70的包封率。色譜條件參考Zhang等[5]的方法并做適當改進：Luna C18色譜柱，波長掃描范圍200～400 nm，定量波長330 nm，柱溫35 ℃，流速 0.5 mL/min，進樣量20 μL，流動相為甲醇(A)/水(B)，梯度洗脫條件為(體積分數)28% A 與 72% B(0～10 min)，48% A 與 52% B(10～40 min)。

配制0.01 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L的BLF70標準溶液，使用0.22 μm微孔濾膜過濾器過濾后，進樣20 μL，采用用峰面積歸一化法繪制標準曲線。取3 mL NSLS/BLF懸濁液于截留分子量為10 kD的離心超濾管中，離心(4000 r/min)30 min后，取下部濾出液進樣，按如下公式計算包封率(η)：

η=(m0-m1)/m0×100%

式中，η為包封率，%；m0為樣品中BLF70總質量，mg；m1為樣品中游離BLF70質量，mg。

1.2.3 NSLS/BLF的漂白

取殼聚糖(CS)溶于1%乙酸溶液中，加熱攪拌至 CS 完全溶解。將NSLS/BLF通過恒流泵以一定速度滴入CS溶液中，使CS ： LS/CTAB(m/m)分別為0%、0.5%、1%、3%、6%、12%、18%、24%。攪拌5 h后，真空冷凍干燥 48 h，得漂白后改性木質素磺酸鈉基竹葉黃酮納米膠體球(NSLS/BLF/CS)。以亨特白度、外觀、復溶時間、復溶后外觀為指標，考察不同CS添加劑量對NSLS/BLF/CS漂白效果和品質的影響。

使用彩譜色差儀分析各個樣品的亨特白度。在3個隨機位置測量每個樣品的L(亮度)、a(紅色)和b(黃色)值，記錄并計算平均值。亨特白度(W)根據以下等式計算[23]：

式中，L、a、b是各個樣品的顏色值。

1.2.4 NSLS/BLF/CS的表征

紫外光譜：配制一定濃度的樣品醇溶液，吸取1.5 mL至石英比色皿，掃描波長范圍為240～400 nm。波長范圍 200～400 nm。FTIR：采用溴化鉀壓片法，分辨率4 cm-1，掃描次數32次，掃描范圍為4000～400 cm-1。DSC：掃描范圍為20～350 ℃，升溫速度 10 ℃/min，氮氣流速30 mL/min。粒徑及電位測定：采用粒徑及電位分析儀測定，重復3次實驗。

1.2.5 NSLS/BLF/CS的紫外吸收活性

分別將BLF70(2.5%、5%、7.5%)、NSLS/BLF/CS(2.5%、5%、7.5%)與無防護作用的空白霜(水、甘油、礦脂、二辛基醚、聚二甲基硅氧烷、甘油硬脂酸酯、鯨蠟醇、甜扁桃油、PEG-30硬脂酸酯、生育酚乙酸酯、聚二甲基硅氧烷醇、苯甲醇、苯氧乙醇、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、丙二醇、EDTA二鈉、氫氧化鈉、葵花籽油)混合后，置于磁力攪拌器上，在25 ℃下以250 rpm的攪拌速度避光攪拌5 h，得到含有不同防曬成分的防曬霜。

將3 M醫用膠帶黏貼在2 mm厚的干凈石英載玻片上，利用注射器將防曬霜樣品均勻點滴在膠帶表面，樣品在膠帶表面的分布為2 mg/cm2。將涂抹好樣品的玻片避光干燥20 min，利用紫外積分球檢測器對其掃描，測試紫外透過率。掃描波長范圍為280～400 nm，取點間隔為1 nm，每個樣品重復測試3次[24]。樣品的SPF值通過下列等式計算[25]：

式中，Eλ表示CIE紅斑光譜有效性；Sλ表示太陽光譜輻照度；Tλ表示樣品的光譜透射率。

1.2.6 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行實驗數據分析，計算結果以平均值±標準差(Mean ± SD)表示。

2 結果與討論

2.1 NSLS/BLF的制備參數優化

采用用峰面積歸一化法制得BLF70標準曲線為：

y=3.951300x-143420(r=0.996，n=5)

式中，y為BLF70峰面積；x為BLF70濃度，mg/mL。

正交實驗中各組的包封率及其分析結果如表2所示。選取正交結果最優條件A2B2C1D4、k值最優結果A2B2C3D4進行驗證試驗。通過3次重復試驗可知，正交最優條件得出NSLS/BLF的平均包封率為(80.57±0.55)%，高于k值最優條件平均包封率(70.45±0.97)%。因此優化后NSLS/BLF的制備參數為：LS/CTAB濃度3 g/L、LS/CTAB與BLF70質量比10:1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s，此時包封率為(80.57±0.55)%，且各因素對包封率影響程度的主次順序為B(LS/CTAB與BLF70質量比)> A(LS/CTAB濃度)> C(正己烷含量)> D(恒流泵流速)。

表2 自組裝制備NSLS/BLF的正交試驗結果及分析Table 2 Orthogonal experiment results of NSLS/BLF prepared by self-assembled

續表2

2.2 殼聚糖添加量對NSLS/BLF/CS色澤和質構的影響

如圖1(a) 所示，不添加CS的NSLS/BLF/CS白度極低，且凍干后呈針晶狀，極大限制其在高端化妝品中的使用。

如表3所示，CS添加量為0%～1% CS時，NSLS/BLF/CS白度具有顯著性差異，添加1%CS后樣品的亨特白度提高230.56%；同時NSLS/BLF/CS外觀從針晶狀轉變為蓬松粉末狀，且復溶時間短、復溶后溶液保持均勻半透明狀。當CS添加量為1%～24% CS時，NSLS/BLF/CS白度提高不明顯，且樣品外觀從蓬松粉末狀轉變為絮狀，復溶時間延長、溶液混濁。

這說明添加低濃度殼聚糖在改善色澤和質構上起重要作用。因此，CS的最佳添加量為1%。

表3 添加不同量殼聚糖對NSLS/BLF/CS色澤和質構的影響Table 3 Effect of the amount of CS on the color reduction and texture improvement of NSLS/BLF/CS

圖1 添加不同量殼聚糖(w/w)后NSLS/BLF/CS的外觀Fig.1 Appearance of NSLS/BLF/CS with different amount of CS

2.3 NSLS/BLF/CS的表征

2.3.1 NSLS/BLF/CS的組成

在最佳制備參數下(即LS/CTAB濃度3 g/L、LS/CTAB與BLF70質量比10:1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s、殼聚糖添加量1%)，BLF70的包封率為(80.57±0.55)%，此時NSLS/BLF/CS的組分構成如下：7.2%～9%的竹葉碳苷黃酮，90.1%～91.8%的改性木質素磺酸鈉，0.9%～0.91%的殼聚糖。

2.3.2 外觀、粒徑及電位測定

NSLS/BLF/CS的粒徑和電位分布曲線如圖2所示。NSLS/BLF/CS粒徑范圍為164～712 nm，重復三次實驗測得平均粒徑為(402.5±21.0) nm，多分散指數(PDI)為0.351±0.006，這說明其分布較為均一。NSLS/BLF/CS的電位范圍為-33～-0.4 mV，平均電位為(-22.1±1.47) mV。

圖2 NSLS/BLF的粒徑和電位分布曲線Fig.2 Particle size distribution and average potential of NSLS/BLF/CS

NSLS/BLF/CS的SEM圖像見圖3。如圖3所示，NSLS/BLF/CS的形態規則，呈球形或類球形，大小較均勻。

圖3 NSLS/BLF的SEM照片Fig.3 SEM image of NSLS/BLF/CS

2.3.3 紫外光譜

圖4為BLF70、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS的紫外吸收光譜圖。如圖所示，LS/CTAB僅在280 nm出現最強吸收峰，而BLF70和NSLS/BLF/CS在270 nm和330 nm附近均出現典型竹葉碳苷黃酮帶Ⅰ和帶Ⅱ吸收峰，初步說明BLF70與LS/CTAB發生交合作用。

圖4 BLF70、LS/CTAB、NSLS/BLF/CS的紫外吸收光譜圖Fig.4 UV absorption spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.3.4 紅外光譜

底物(BLF70、LS/CTAB)和產物(NSLS/BLF/CS)的紅外吸收光譜圖見圖5所示。NSLS/BLF/CS的主要特征峰包括：3424 cm-1的O-H伸縮振動峰、2921 cm-1的C-H反稱伸縮振動峰和 2851 cm-1的C-H對稱伸縮振動峰，存在LS/CTAB的特征吸收峰，如1037 cm-1的芳醚=C-O-C對稱伸縮振動峰及其他彎曲振動峰(1464 cm-1的烷烴-CH面內彎曲振動峰、1425 cm-1的烯烴-CH面內彎曲振動峰、1329 cm-1的-OH面內彎曲振動峰)，同時存在部分BLF70的特征吸收峰，如1707 cm-1的C=O 伸縮振動峰，1612 cm-1和1517 cm-1的苯環骨架振動峰， 1116 cm-1的酚類ɑ-O 伸縮振動峰，但這些特征吸收峰強度明顯降低，且彎曲振動的指紋區域部分消失，如1459、1352和1077 cm-1等，這表明BLF70與 LS/CTAB分子間發生相互作用， LS/CTAB自組裝后包埋BLF70形成了納米膠體球。

圖5 BLF70 、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS 的紅外吸收光譜圖Fig.5 FTIR spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.3.5 差式掃描量熱分析

BLF70、LS/CTAB 和NSLS/BLF/CS的差式掃描量熱分析曲線圖見圖6所示。從圖中可知，三者均有兩個吸熱峰，分別為失水峰和熔融峰。BLF70的熔融曲線光滑，熔融溫度為112.58 ℃，熱焓值為 21.9 J/g；LS/CTAB的熔融曲線光滑，熔融溫度為254.05 ℃，熱焓值為 75.47 J/g；而NSLS/BLF/CS僅存在一個熔融峰，表明BLF70與LS/CTAB已通過自組裝形成均一膠體，這與紅外光譜分析結果一致；BLF70和LS/CTAB的相互作用提高兩者的穩定性，因此NSLS/BLF/CS的熔融溫度提高至260.88 ℃，熱焓值提高至 82.54 J/g；NSLS/BLF/CS熔融曲線不光滑，可能是由于不同顆粒尺寸(164～712 nm)的熔融速率不同導致的。

圖6 BLF70 、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS 的差式掃描量熱分析曲線圖Fig.6 DSC spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.4 NSLS/BLF/CS的紫外吸收活性

如圖7 所示，防曬乳液的SPF值隨BLF70和NSLS/BLF/CS質量分數的增加而增加，且含NSLS/BLF/CS的防曬乳液SPF值增速更快。當兩者添加量均為7.5%時，含NSLS/BLF/CS防曬霜的SPF值是含BLF70的2.63倍，這說明通過自組裝制得的NSLS/BLF/CS明顯提高了BLF70的防曬性能。

圖7 防曬霜的SPF 值與BLF70、NSLS/BLF/CS添加量的關系圖Fig.7 The SPF value of the pure creams blended with different amounts of BLF70 or NSLS/BLF/CS

3 結 論

本文將高精度竹葉黃酮與木質素復配。對木質素磺酸鈉疏水改性，于無水乙醇-正己烷體系中自組裝，在改善色澤的同時，解決了木質素無規團聚、表面極性不均勻等問題。通過正交試驗可知最佳制備參數為：LS/CTAB濃度3 g/L、LS/CTAB與BLF70質量比10∶1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s，此條件下納米膠體球包埋率為(80.57±0.55)%。將殼聚糖作為降色劑吸附于納米膠體球表面，當添加量為1%時，納米膠體球的亨特白度提高230.56%。此納米膠體球有助于解決竹葉黃酮和木質素在化妝品應用中普遍存在的產品色澤差的問題。含NSLS/BLF/CS防曬霜的SPF值是含BLF70的2.63倍，即通過自組裝制得的NSLS/BLF/CS明顯提高了BLF70的防曬性能，因此NSLS/BLF/CS在日化產品，尤其是防曬產品中具有良好的應用前景。而納米膠體球與現有的物理、化學防曬劑是否存在協同作用，以及該納米膠體球的其他生物學活性有待進一步探究。