食品接觸材料中化合物的非靶向篩查技術研究進展

蘇啟枝, 董 犇, 李 丹, 鐘懷寧

（廣州海關技術中心, 國家食品接觸材料檢測重點實驗室（廣東）, 廣東 廣州 510623）

從陶瓷、玻璃、木制品、紙、帶有機涂層的金屬罐到傳統石油基塑料、硅橡膠及新型可降解塑料等, 不同材質的食品接觸材料無處不在, 為人們的生產和生活提供了諸多便利。在食品接觸材料生產過程中, 往往需要加入一定量的添加劑以提高材料的性能。常見的添加劑有：增塑劑、抗氧化劑、熱穩定劑、光穩定劑和開口劑等, 這些添加劑也被稱為有意添加物。另外, 食品接觸材料也可能含有非人為添加的物質, 即非有意添加物, 包括原輔材料帶入的雜質, 在生產、經營和使用等過程中的分解產物、污染物以及殘留的反應中間產物[1］。在與食品接觸的過程中, 食品接觸材料中有意和非有意添加物都有可能遷移到食品中, 從而給食品安全帶來額外風險。

顧名思義, 靶向篩查技術就是對某些特定物質進行測定。對于給定食品接觸材料, 有些添加劑是可以預期的, 例如聚氯乙烯中的鄰苯二甲酸酯、聚碳酸酯和環氧樹脂中的雙酚A, 這類已知或預期可能存在的物質可以通過靶向篩查技術進行監測。針對目標物性質不同, 可采用適用的分析技術, 如基于氣相色譜-質譜的鄰苯二甲酸酯[2-3］和環氧大豆油[4-5］的測定, 基于液相色譜熒光檢測器的雙酚類污染物的測定[6-7］, 基于液相色譜二極管陣列檢測器的抗氧化劑、光穩定劑、鄰苯二甲酸酯和光引發劑的測定[8］, 基于離子遷移譜的甲基丙烯酸甲酯的測定[9］, 基于酶聯免疫吸附分析技術的鄰苯二甲酸二丙酯的測定[10］, 基于液相色譜-串聯質譜的光引發劑的測定[11］, 以及基于液相色譜-質譜（LC-MS）的芳香胺的測定[12］。

雖然部分非有意添加物已經為人們所熟悉, 如抗氧化劑168的氧化產物、2, 4-二叔丁基酚和壬基酚[13］, 但也有一些非有意添加物可能是未知的, 甚至是難以預測的（例如外部污染物）, 在確定物質結構之前, 難以對其進行毒理學評估。就食品接觸材料的安全性而言, 僅關注有意添加物可能不夠, 非靶向篩查技術為全面了解食品接觸材料提供了可能。與靶向篩查不同, 非靶向篩查并無特定目標物, 其旨在盡可能多地檢測和分析樣品中含有的化合物。在非靶向篩查中, 由于目標物未知, 很難對樣品分析方法, 包括樣品前處理方法及儀器參數等進行優化。另外, 非靶向篩查技術的一個重要任務是對檢出的物質進行定性分析。在食品接觸材料研究領域, 氣相色譜、液相色譜與質譜聯用是最常用的非靶向篩查技術。得益于分離效率高、分析時間短、樣品及溶劑消耗量低和操作簡單等優點, 毛細管電泳技術被認為是色譜分離技術的有效替代方案, 其與質譜聯用已被用于食品接觸材料中有機錫和二苯甲酮型紫外吸收劑等物質的靶向篩查[14-15］, 但其在食品接觸材料化合物非靶向篩查中的應用仍未見報道。核磁共振技術能夠提供豐富的物質結構信息且具有分析時間短、無損分析和通量高等特性, 但靈敏度較低[16］, 在食品接觸材料領域, 常用于化合物結構的確定, 特別是對于沒有標準品的物質如聚酯涂層及硅膠中低聚物[17-18］的進一步確認, 而較少用于食品接觸材料的非靶向篩查。在借助質譜對化合物進行鑒定時, 質譜庫的使用很重要, 但質譜庫的范圍很有限（特別是適用于液質系統的質譜庫）。在沒有質譜庫匹配的情況下, 化合物的定性依然是一個很大的挑戰, 常常需要借助高分辨率質譜、質譜解析技術或先進的數據處理方法。

本文綜述了食品接觸材料中化合物的非靶向篩查技術, 總結了食品接觸材料中化合物的直接提取和遷移實驗兩種提取方法, 介紹了應用氣相色譜-質譜、液相色譜-質譜對揮發、半揮發及非揮發性物質進行定性的方法, 重點給出了非揮發性物質結構推導的流程及重要考量因素, 并分析了開放質譜庫、開源數據處理工具、預測模型及與食品接觸材料相關的化學結構數據庫在食品接觸材料組分鑒定中的潛在應用, 以期為提高食品接觸材料組分特別是非有意添加物的檢測分析能力提供借鑒, 從而有效提升對食品接觸材料安全性的評估能力。

1 化合物提取方法

一般來說, 小分子物質如添加劑及非有意添加物均勻地分布而非通過化學鍵固定在基材中[19］, 通常需要將其從基材中提取出來再進行測定。如圖1所示, Nerín等[20］總結了樣品處理的一般方案。總的來說, 提取方法有兩種：直接提取技術和遷移實驗。

圖1 食品接觸材料樣品處理的一般方案[20］Fig. 1 General scheme of sample preparation of food contact materials[20］

1.1 直接提取技術

在直接提取技術中, 熱脫附結合頂空法、固相微萃取法和吹掃捕集法等可實現自動化并直接與氣相色譜相連, 不需要復雜的樣品前處理[20］, 方法簡單便捷, 普遍應用于食品接觸材料揮發性成分的檢測[21-24］。然而, 此類方法主要適用于揮發性物質, 半揮發和非揮發性物質因較難釋放出來, 適用性較差。

與熱脫附不同, 固液萃取技術適用于不同揮發性物質。借助索氏提取[25］、微波輔助提取[26］、快速溶劑萃取[8］和超聲輔助提取[27］等方法, 食品接觸材料中的化合物可被如二氯甲烷、正己烷和乙腈等不同極性溶劑提取出來。除此以外, 完全溶解法也可用于塑料食品接觸材料中化合物的提取。根據聚合物不同, 溶解溶劑可能不同, 如六氟異丙醇用于聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）[28］的提取, 鄰二甲苯[29］或甲苯[30］用于聚烯烴, 四氫呋喃或二氯甲烷用于聚苯乙烯[31］, 氯仿用于聚碳酸酯[32］；甲醇則最常用作沉淀溶劑, 但在沉淀過程中, 部分化合物可能會被重新包裹進聚合物中, 從而導致提取效率不佳。

1.2 遷移實驗

遷移實驗是指根據食品接觸材料實際使用情況選擇合適的條件（接觸時間和溫度）將其直接暴露于真實食品或規定的食品模擬物中, 并分析實際遷移出來的成分。相比遷移實驗, 固液萃取在相同的檢測方法下通常可以檢出更多組分。因此, 一種常見做法是先對材料進行固液提取, 然后對提取液進行非靶向篩查, 最后在遷移液中選擇感興趣的目標物進行定量分析[28, 33-34］。然而, 就安全性而言, 只有遷移到食品中的物質才會給消費者帶來安全風險。此外, 有些物質可能會與食品模擬物或真實食品發生反應, 從而產生新物質。這些新產生的物質與消費者安全息息相關且只能通過遷移實驗才能發現, 例如研究發現部分物質在水性食品模擬物中會發生水解, 產生新物質[35-36］。從這個角度來說, 建立和提高食品或食品模擬物中遷移物的非靶向篩查技術更值得關注。

國標GB 31604. 1-2015規定了遷移實驗的條件和食品模擬物的選擇[37］。在遷移實驗后, 應選擇合適的分析方法來測定食品模擬物中的遷移物。10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、95%乙醇和4%乙酸均可直接進行液相色譜分析, 但含水量高的樣品不宜直接進入氣相色譜分析。為了獲得更高靈敏度或使其適用于儀器, 可對食品模擬物使用不同的萃取方法, 如頂空、固相微萃取[38］、液液萃取、液液微萃取等。對于使用真實食品進行遷移實驗而言, 非靶向篩查更具有挑戰性, 因為很多食品基質復雜, 如蛋白質、油脂和糖類等, 這使得樣品前處理和數據分析更為困難。

2 化合物的定性

2.1 揮發性及半揮發性物質

圖2顯示了揮發及半揮發性物質定性的一般流程。氣相色譜-質譜使用固定的電離能（70 eV）, 使得不同儀器上得到的質譜圖具有高度重復性。因此, 多年來氣相色譜-質譜庫得到了長足的發展和廣泛的應用。NIST氣相色譜-質譜庫包含數十萬個物質的標準譜圖, 被廣泛用于食品接觸材料成分的鑒定, 如常見的烷烴、烯烴、脂肪酸酯、增塑劑（鄰苯二甲酸酯和乙酰檸檬酸三丁酯等）、抗氧化劑（BHT、抗氧化劑168和1076等）、光引發劑（二苯甲酮）和部分常見的非有意添加物（2, 4-二叔丁基酚、壬基酚和7, 9-二叔丁基-1-氧雜螺[4. 5］癸-6, 9-二烯-2, 8-二酮等）[33, 39-42］, 是食品接觸材料中揮發及半揮發性污染物定性的首要選擇。然而, 對于不在質譜庫中的物質, 如新的非有意添加物, 對其進行準確定性仍具挑戰性, 常需與軟電離技術和高分辨率質譜聯用, 如大氣壓電離氣相色譜串聯飛行時間質譜（APGC-QTOF MS）[43-45］。這種方法能夠得到具有精確分子量的母離子和碎片離子, 從而為結構推導提供有用信息[46］, 但其通常作為普通氣相色譜-質譜的補充, 很少單獨用于非靶向篩查, 因為大部分物質都能夠通過普通氣相色譜-質譜結合質譜庫進行定性, 不需要復雜耗時的結構推導。結構推導與下文中非揮發性物質的結構推導類似（“2. 2”小節）, 此處不再詳細描述。

圖2 揮發及半揮發性物質定性的一般流程Fig. 2 Workflow for the identification of（semi-）volatile compounds

保留時間指數（RI）法由于成本低、容易使用且不受儀器和條件的影響, 被廣泛用于提高定性準確率, 降低假陽性概率。目前, NIST庫中只有少部分物質有實驗RI值, 大部分物質的RI值依然缺失。對于沒有實驗RI值的物質可以使用模型對其進行預測[47-49］, 在缺乏標準品的情況下, 如新的非有意添加物, 預測RI可以作為一個額外的參數來提高定性的準確性和可靠性[50］。

2.2 非揮發性物質

液相色譜-質譜是測定非揮發性物質最常用的技術, 可使用不同的電離源, 最常見的有電噴霧電離、大氣壓化學電離、大氣壓光電離、基質輔助激光解吸電離和直接電子電離[51］。在軟電離模式下, 母離子被最大限度的保留, 為分子式的測定帶來了方便；而在碰撞室中, 母離子被打碎, 產生碎片離子, 使結構推導成為可能[46, 52］。

在數據采集方面, 可分為數據依賴型（DDA）和非數據依賴型（DIA）采集。如圖3A所示, 在DDA中, 只有少數高于用戶設定豐度閾值的母離子被送至碰撞室中, 產生二級質譜（MS2）, 其他的離子則沒有二級質譜, 從而無法進行結構推導。雖然其二級質譜背景干擾小, 但當有多個物質被共同洗脫出來時, 低豐度的母離子會被忽略, 使得覆蓋范圍變窄[52］。在DIA中, 一級質譜（MS1）中的所有離子都會進入碰撞室, 產生二級質譜（圖3B）。其優點是覆蓋范圍廣, 但二級質譜較復雜, 很難找到母離子和碎片離子的對應關系, 需要借助足夠的解卷積算法[52-53］。

圖3 數據依賴型（A）和非數據依賴型（B）采集模式的對比[52］Fig. 3 Comparison between data dependent analysis（A）and data independent analysis（B）[52］

圖4顯示了非揮發性物質定性的一般流程。與氣相色譜-質譜圖不同, 不同儀器和參數下的液相色譜-質譜圖可能相差很大, 使得建立可靠、適用于所有儀器及參數的液相色譜-質譜庫變得困難[54］。盡管如此, 近年來, 液相色譜-質譜庫仍在不斷擴大, 以期更快更準確地對非揮發性物質進行定性。其質譜圖有以下兩個特點：其一, 必須有母離子, 在質譜匹配時, 只有母離子相同的譜圖才會被用于匹配；其二, 譜圖有正負離子模式之分, 所以一般會根據正負離子模式不同使用相應的譜庫。目前, NIST 2020包含超過3萬個化合物, 總計132萬張高分辨液相色譜-質譜圖, 但由于很多儀器自帶的軟件并不支持直接使用這個質譜庫, 故其在食品接觸材料領域未能得到充分利用。一種可行的辦法是使用Lib2NIST Converter軟件將NIST庫轉成*. msp格式供其他軟件如MS-DIAL使用。Metlin和mzCloud是另外兩個商業液相色譜-質譜庫, 其中前者曾被用于食品級多層塑料包裝組分的非靶向篩查[55］, 但只有一個組分（己內酰銨）通過匹配Metlin質譜庫得到鑒定, 可能是因為Metlin包含的物質大多為代謝產物而非食品接觸材料相關物質。除此以外, 也有一些公開的高分辨率液相色譜-質譜庫, 如MoNA、RIKEN、GNPS等[56］, 供大家下載和使用。這些譜庫主要來源于代謝組學, 但也包含越來越多環境污染物, 如農藥和藥物, 其對食品接觸材料領域的價值尚不明確, 值得進一步探索。

圖4 非揮發性物質定性的一般流程Fig. 4 Workflow for the identification of nonvolatile compounds

對于未能通過質譜匹配定性的物質, 通常需要進行結構推導。結構推導的第一步是確定分子式[57］, 其前提是準確地找出母離子和相應的加合物（Adduct）。在軟電離模式下, 通常一級質譜中豐度最大的離子是較為重要的母離子, 多用于分子式的確定。有時, 一個物質會同時形成多個母離子, 通過計算母離子間的精確質量差, 可以推導出每個母離子的加合物形式。在正離子模式中常見的加合物有[M+H］+、[M+Na］+、[M+NH4］+、[M+K］+、[2M+H］+、[2M+Na］+、[2M+NH4］+和[2M+K］+, 而在負離子模式下則常有[M-H］-和[2M-H］-。當一個物質可同時在正負離子模式下電離時, 則正負離子模式下母離子的質量差也可幫助推導加合物形式。通常母離子和加合物確定后, 軟件可根據用戶設定的元素類型、原子數量、允許質量誤差和同位素誤差等, 計算所有可能的分子式。如Cristina等[20］指出, 在食品接觸材料中常見的元素有C、H、O、N、S, 但P、Cl、F和Br也是可能的。為了篩除在化學上不合理的分子, 可使用一些化學規則, 如雙鍵當量、環雙鍵當量、氮規則、LEWIS和SENIOR規則等[57］, 或結合二級質譜中的碎片模式[58-59］、啟發式規則如七條金規則[60］和氫重排規則（MS-FINDER）進行篩查。

分子式確定后, 可借助一些理論電離工具（In-silico fragmentation）來推導化合物的結構, 如基于分裂規則的MS-FINDER和MassFrontier[57］或基于機器學習的SIRIUS4等。舉例來說, MS-FINDER可在計算給定母離子的分子式后, 將用戶選定的結構數據庫中所有匹配上該分子式的化合物進行理論電離, 產生in-silico質譜圖, 并與實際獲得的二級質譜進行對比和打分, 從而給出可能的結構（Candidates）。通常, 可能的結構并不唯一, 而得分最高的結構也并不一定是正確的。目前, 有多種方式可以對可能的結構進行優先排序。其中, 最常用的是數據源相關規則, 即一個物質存在于與研究對象相關的數據庫中, 說明這個物質可能已經在同類材料中被檢出過, 而其在科學文獻和專利中的被引數則在一定程度上說明了該物質的普遍性[57］。根據所研究的對象選擇相關的數據庫會在一定程度上減少可能結構的數量。數據源相關規則適用于已知未知物, 卻無法應對未知未知物。對未知未知物而言, 通常定性難度更大, 需要結合樣品信息和已檢出物質等推測可能的結構, 如某些已知物的降解或反應產物, 最后可通過理論電離工具輔助判定。

上述理論電離工具中已經集成了一些結構數據庫, 但大都與代謝組學相關而與食品接觸材料無關。在食品接觸材料領域, Groh等先后整合了兩個與食品接觸材料相關的數據庫, 分別是塑料包裝相關化合物數據庫（CPPdb）[61］和食品接觸用有意添加物數據庫（FCCdb）[62］, 將其作為結構數據庫用于結構推導可能會對食品接觸材料相關組分的鑒定具有重要作用, 但目前其應用仍較少。CPPdb包含了兩個綜述[20, 63］中列出的非有意添加物, 但其所包含的非有意添加物的數量依然很有限, 更遑論未知的非有意添加物。值得注意的是, 文獻中很多初步定性的非有意添加物大多缺乏結構信息（InChI和SMILES）, 如低聚物[28, 64-65］和在輻照下新生成的化合物[66］, 從而給結構數據庫的整合帶來困難。

另一種對可能結構進行排序或提高定性準確性的方法是采用與色譜保留行為相關的規則。如“2. 1”所述, 在氣相色譜-質譜的結構推導中, 實驗及預測保留時間指數最為常用, 但在液相色譜中, 物質在色譜中的保留行為受諸多因素影響, 如pH值、溫度、緩沖鹽和流動相等, 使得建立一個類似保留時間指數的數據庫和建立一個通用的保留時間模型變得異常困難。盡管如此, 仍有很多研究人員致力于建立和提高適用于液相色譜的保留時間預測模型[67-71］。對非靶向篩查而言, 一些實驗室可能會使用固定的儀器參數和設定。因此, 他們可以建立自己的保留時間數據庫, 并在此基礎上建立保留時間預測模型。Bonini等[69］建議, 為了建立較好的預測模型, 保留時間數據庫至少要有300個物質的數據。

在液相色譜-質譜的基礎上增加離子淌度可以區分同分異構體并生成多維度數據, 從而提高定性的準確性[72］。與保留時間不同, 通過離子淌度獲得的碰撞截面積（CCS）不隨實驗條件的改變而改變, 可以作為額外的指標幫助化合物定性[73］。近年來, 實驗CCS值的數量不斷增長, CCS預測模型也被用于提高化合物的定性準確率, 如MetCCS[74］、DeepCCS[75］和AllCCS[76］。近期, Song等[77-79］發布了包含675個與食品接觸材料相關的物質的CCS數據庫并建立了相應的CCS預測模型, 有望進一步幫助提高食品接觸材料組分定性的準確率。

3 數據處理軟件

儀器自帶的軟件是分析相應數據的強有力工具。近年來, 受益于新穎性、開源和可重復性, 開源數據處理軟件得到越來越多的關注[80］, 但在食品接觸材料領域, 開源工具的使用有限, 故值得關注和嘗試。不同儀器廠商的數據常常使用各自特有的數據格式, 給其他開源工具的讀取帶來一定困難。ProteoWizard的msConverter是最常用的數據轉換工具之一[81］, 但隨著開源工具的不斷改進, 一些工具已經可以直接讀取來自不同儀器的原始數據, 簡化了數據處理流程, 提高了數據處理的效率。

質譜處理數據中的一個重要步驟是解卷積, 這是一個借助計算機來分離共洗脫組分的過程, 可為每個組分提供盡可能少干擾的質譜圖, 提高定性的準確率[82］。就氣相色譜-質譜數據而言, AMDIS廣為人知, 也有一些開源軟件可以實現類似的功能, 包括：XCMS（基于網頁或R語言環境）[83］、Mzmine2[84］、MS-DIAL[85］和GNPS[86］等。這些工具整合了基于提取離子的峰檢測、解卷積、峰對齊以及峰過濾等功能, 將解卷積和過濾后的質譜圖導入到一些軟件如NIST MS Search中進行譜圖匹配即可實現定性。

XCMS、MZmine2、MS-DIAL和GNPS也可以處理液相色譜-高分辨率質譜聯用的數據。相比其他平臺, GNPS用戶可以將數據上傳到GNPS的服務器中進行分析、保存和分享, 使得讀者可以直接進入到原始數據中進行查看, 甚至是再分析[87］。和氣相色譜-質譜數據相比, 液相色譜-質譜數據更為復雜, 其中一個廣為人知的問題是源內電離。在軟電離中, 一些物質會形成多種加合物和產生源內電離碎片。在峰檢測過程中, 大量的源內電離碎片和加合物會被認為是單獨的離子峰, 但是它們并不一定都是獨立的化合物, 而可能是同一個化合物的不同碎片或加合物。因此, 研究人員開發了一些工具來對這些離子峰進行整合, 最后只保留最重要的離子峰及其二級質譜進行定性。這些工具有CAMERA[88］、CliqueMS[89］和MS-CleanR[90］等。在進行質譜匹配后, 依然未能被定性的物質可以通過“2. 2”所述方法進一步定性。就結構推導而言, 除去儀器自帶的工具, 如Waters公司的Masslynx和UNIFI、ThermoFisher的MassFrontier和Agilent的MassHunter工作站等, 也有一些開源工具被開發出來, 如MAGMa[91］、CSI：FingerID[92］、MetFrag[93］、MS-FINDER[58］、CFM-ID[94］、SIRIUS4[59］和MolDiscovery[95］。

4 結論與展望

食品接觸材料的安全性越來越受到重視, 對其組分的非靶向篩查也越發重要。雖然從樣品提取液中可能檢測出更多的組分, 但是考慮到化合物特別是非揮發性物質定性分析的復雜性, 對遷移試樣進行非靶向篩查可能更為直接有效。部分物質可能存在于食品接觸材料中但并不會遷移到食品或食品模擬物中, 因此, 與消費者暴露和食品接觸材料的安全無關。由于化合物的遷移量通常較低, 不易被檢出, 樣品濃縮、液液萃取、固相微萃取等方法可以提高對它們的檢出能力。在非靶向篩查中并無固定目標物, 使得對樣品處理方法、儀器參數等進行優化并不容易, 不同的實驗室尚未達成共識。

質譜對于化合物的定性具有重要作用。在揮發性物質的定性中, 商業質譜庫如NIST的作用無可替代；在非揮發性物質的定性中, 雖然也有商業質譜庫, 但其覆蓋面還很小。多個公開質譜庫并非為食品接觸材料領域建立, 其在該領域的作用尚不明確, 但是值得嘗試和拓展。對于未能通過質譜匹配進行定性的物質, 高分辨率質譜是非常重要的工具。開源工具更新快, 緊跟學界技術前沿, 可以更多的嘗試應用于食品接觸材料領域, 提高數據處理的效率和準確率。加快建立與食品接觸材料相關的質譜庫和化學結構數據庫可以加快和簡化質譜數據的處理。同時, 保留時間指數和碰撞截面積預測模型的建立和應用可以提高對于這些未知物, 特別是非有意添加物的定性能力, 但是該工作依然非常具有挑戰性。