鹽析輔助液液萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定含乳飲料中12種鄰苯二甲酸酯

王東旭, 王新財, 胡奇杰, 王鳳麗, 厲 芬

（湖州市食品藥品檢驗研究院, 浙江 湖州 313000）

含乳飲料是指以乳或乳制品為原料, 加入水及適量輔料經配制或發酵而成的飲料制品[1］。研究表明, 含乳飲料是城市年輕人群僅次于礦泉水之外銷量最高的飲品[2］。飲料包裝較多使用聚丙烯（PP）、聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、高密度聚乙烯（HDPE）等材質, 受環境等因素影響, 塑料中的單體可能從包裝材料遷移到飲料中, 從而損害人體健康[3］。鄰苯二甲酸酯（PAEs）是其中應用最為廣泛的一類增塑劑, 每年全球產量接近600萬噸, 其中中國消耗量接近220萬噸[4-6］。毒理學研究表明, PAEs分子與雌激素部分結構具有相似性, 對內分泌系統、免疫系統和神經系統有干擾作用, 具有潛在的生物毒性、腎毒性和致畸性[7-9］。目前, 美國環保總局已將鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP）列入“優先污染物名單”；歐盟將DBP、DEP列為第2類生殖毒性化合物[10］。我國食品安全標準也對食品、食品添加劑中的DEHP、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）和DBP的最大殘留量做了限值規定[11］。

目前食品中PAEs的檢測方法主要有氣相色譜法[12］、氣相色譜-質譜法[13-14］、液相色譜法[15-16］以及液相色譜-質譜法[17-18］等。由于食品基質較復雜, 其中PAEs的濃度往往較低, 因此選擇合適的富集和純化前處理技術必不可少[12］。常見的前處理技術主要有液液萃取法[19］、固相萃取法[20］、固相微萃取法[21］、分散液液微萃取法[22］、磁性固相萃取法[23］等。含乳飲料含有較高的脂肪和蛋白質, 前處理的關鍵在于去除脂肪和蛋白質, 目前采用的前處理方法以固相萃取法[24］為主, 但該法檢驗成本高, 操作相對繁瑣, 不適合高通量檢測。鹽析輔助液液萃取法（SALLE）通過向樣品溶液與萃取溶劑混合物中加入適當的無機鹽, 可促進萃取溶劑更好地從混合物中分離[25-26］。該方法具有操作簡便、有機試劑消耗少、萃取效率高等優點。本研究以12種典型的PAEs為檢測目標, 采用鹽析輔助液液萃取法對含乳飲料中PAEs進行前處理, 結合超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）, 建立了一種前處理快速簡單、成本低的含乳飲料中12種PAEs的檢測方法, 可為含乳飲料中PAEs的高通量檢測提供技術參考。同時基于該方法考察了不同溫度及光照條件下PET包裝材質的含乳飲料中PAEs的遷移規律。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

ACQUITYTM超高效液相色譜和XevoTMTQD三重四極桿串聯質譜儀（美國沃特斯公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Genius 3漩渦混合器（德國艾卡公司）；Allegra X-12R型臺式冷凍離心機（美國貝克曼公司）；DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；針式濾膜過濾器：0. 22μm聚醚砜濾膜（PES）、0. 22μm尼龍濾膜（Nylon）、0. 22μm玻璃纖維濾膜（MCE）、聚丙烯濾膜（PP）、0. 22μm聚四氟乙烯濾膜（PTFE）、0. 22μm聚偏氟乙烯濾膜（PVDF）（天津市津騰實驗設備有限公司）。

標準品：DMP、DEP、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（DEEP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、DBP、鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、BBP、鄰苯二甲酸二環己酯（DCHP）、DEHP、DNOP、DINP, 質量濃度均為1 000μg/mL, 購自北京壇墨質檢科技有限公司。

乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、丙酮、四氫呋喃、乙醇（色譜純, 德國默克公司）；甲酸、氯化鈉（NaCl）、碳酸鈉（Na2CO3）、硫酸鈉（Na2SO4）、硫酸銨（（NH4）2SO4）、硫酸鎂（MgSO4）（分析純, 上海麥克林生化科技有限公司）；實驗用水為屈臣氏蒸餾水, 10批次含乳飲料購于湖州市超市。

1.2 溶液制備

1.2.1 混合對照品溶液的制備準確吸取各PAEs標準溶液適量, 用乙腈稀釋, 配制質量濃度為1 mg/L的PAEs混合標準儲備液, -20℃下避光保存。吸取PAEs混合標準儲備液適量, 經空白基質溶液稀釋, 配制質量濃度分別為0、5. 00、10. 0、50. 0、100、200μg/L的混合標準工作溶液。取1. 00 mL混合標準溶液過0. 22μm聚四氟乙烯濾膜后供儀器分析。

1.2.2 供試品溶液的制備準確稱取5. 00 g含乳飲料（精確至0. 01 g）置于15 mL離心管中, 依次加入2. 0 g硫酸銨和1. 5 mL乙腈, 渦旋至硫酸銨固體完全溶解（約1 min）, 以10 000 r/min離心5 min。移取0. 75 mL上層有機層置于1. 00 mL容量瓶中, 加水定容至刻度, 混勻, 過0. 22μm聚四氟乙烯濾膜后供儀器分析。空白實驗未加入樣品, 其他步驟相同。

1.3 測定方法

精密吸取上述混合標準工作溶液各5μL進行超高效液相色譜-串聯質譜檢測, 以進樣質量濃度（X, μg/L）為橫坐標, 定量離子對峰面積（Y）為縱坐標, 繪制12種PAEs基質標準溶液的標準曲線。供試品溶液在相同條件下測定, 采用基質標準曲線外標法定量。

1.4 色譜及質譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH phenyl（50 mm×2. 1 mm, 1. 7μm）；流動相：A為甲醇, B為0. 05%甲酸水溶液；流速為0. 3 mL/min；進樣體積為5μL；柱溫為35℃。梯度洗脫程序：0. 0～1. 0 min, 50%～60% A；1. 0～2. 5 min, 60%～70% A；2. 5～4. 0 min, 70% A；4. 0～4. 5 min, 70%～80% A；4. 5～6. 0 min, 80%A；6. 0～7. 0 min, 80%～90%A；7. 0～12. 0 min, 90%A；12. 0～12. 1 min, 90%～50%A；12. 1～18 min, 50%A。為抑制儀器管路中的塑化劑本底干擾[27］, 在混合池與六通閥之間加裝Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4. 6 mm×150 mm, 5μm）。

質譜條件：電噴霧電離（ESI）源, 正離子模式掃描, 多反應監測（MRM）模式檢測；毛細管電壓為0. 5 kV；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣溫度為350℃；脫溶劑氣流速為800 L/h；錐孔氣流速為50 L/h；碰撞氣為氬氣；PAEs的質譜參數見表1。

表1 待測物的監測離子對及最佳質譜參數Table 1 Selected transitions and optimized mass spectrum parameters of the target compounds

1.5 基質效應

采用相對響應值法考察基質效應（ME）的影響, 計算公式為：ME=k2/k1×100%。式中：k1為空白溶液標準曲線斜率；k2為基質標準曲線斜率。

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2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

在鹽析輔助液液萃取法中影響萃取效率的因素主要有萃取溶劑、鹽析劑的種類及用量等。萃取溶劑一般選擇既能溶于水又能在鹽析劑作用下與水分層的溶劑, 因此本研究考察了乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和四氫呋喃5種常見萃取溶劑的效果。結果表明, 加入硫酸銨后, 除甲醇外, 其余4種溶劑均發生了有機相和水相的分離, 4種溶劑中PAEs的萃取回收率大小順序為乙腈＞丙酮＞乙醇＞四氫呋喃, 考慮到乙腈有沉淀蛋白的作用, 所以選擇乙腈作為萃取溶劑。

實驗還考察了氯化鈉、碳酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂5種常見鹽析劑的效果。結果表明硫酸銨的萃取回收率最高, 其原因可能由于硫酸銨具有更好的水溶性和更強的鹽析能力, 因此選擇鹽析劑為硫酸銨。進一步對乙腈和硫酸銨的用量進行了優化, 結果見圖1。綜合考慮萃取回收率和節省試劑, 得到優化的前處理條件為：5. 00 g含乳飲料中添加1. 5 mL乙腈和2. 0 g硫酸銨。

圖1 乙腈（A）與硫酸銨（B）用量的影響（n=3）Fig. 1 Effects of the dosage of acetonitrile（A）and（NH4）2SO4（B）（n=3）

2.2 背景消除

由于環境中無處不在的塑化劑和來自于分析系統本身的干擾, PAEs檢測過程中的本底干擾非常高, 本實驗在混合池與六通閥間加裝C18反相色譜柱, 能很好地消除系統背景中塑化劑的干擾。同時, 檢測時要扣除試劑空白帶來的本底, 以保證定性和定量分析結果的準確性。研究發現, 常見濾膜會引入PAEs, 實驗篩選了聚醚砜濾膜、尼龍濾膜、玻璃纖維濾膜、聚丙烯濾膜、聚四氟乙烯濾膜、聚偏氟乙烯濾膜6種濾膜, 每種濾膜過濾相同體積的空白樣液, 發現聚四氟乙烯濾膜可以有效避免PAEs的引入。

2.3 基質效應

鑒于含乳飲料基質較為復雜, 本研究按照“1. 5”方法考察基質效應的影響, 若基質效應在80%～120%之間, 說明可忽略基質的影響, 采用溶劑標準曲線定量即可；反之, 則應考慮基質效應對實際檢驗結果的影響。結果顯示, 12種PAEs的ME為33. 5%～55. 3%（見表2）, 存在較強的基質抑制效應。通常消除基質效應的方法有同位素內標法和基質匹配標準曲線法, 考慮到12種PAEs的同位素內標獲取難度大, 成本較高, 因此本方法采用基質標準曲線外標法定量。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

將“1. 2. 1”中系列質量濃度的PAEs混合標準工作溶液依次按照本方法進行測定, 繪制12種PAEs的標準曲線（見表2）。結果顯示, 12種目標物的線性關系良好, 相關系數（r2）不小于0. 997。12種PAEs混合標準工作溶液（10. 0μg/L）的色譜圖見圖2。由圖2可見, 12種PAEs分離完全, 峰形對稱, 無雜峰干擾, 可以滿足定量檢測要求。采用在空白含乳飲料中添加3倍預估檢出限濃度目標組分的方法, 以信噪比S/N=3和S/N=10分別確定各組分的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結果表明, 12種PAEs的檢出限為0. 03～0. 6μg/kg, 定量下限為0. 1～2. 0μg/kg（見表2）。GB 5009. 271-2016《食品安全國家標準食品中鄰苯二甲酸酯的測定》國標方法中PAEs的定量下限最低為0. 3 mg/kg[28］, 因此本方法的靈敏度優于或與國標方法相當, 且本方法檢測時間縮短10 min, 并降低了有機試劑用量。

圖2 PAEs混合標準工作溶液的色譜圖（10. 0μg/L）Fig. 2 Chromatograms for mixed standard solution of PAEs（10. 0μg/L）

表2 12種PAEs的線性關系、檢出限、定量下限及基質效應Table 2 Linear relations, limits of detection（LODs）, limits of quantitation（LOQs）and matrix effects（MEs）of 12 PAEs

2.5 準確度與精密度

在空白含乳飲料樣品中分別加入低、中、高及LOQ 4種濃度的PAEs混合標準溶液, 按照本方法重復測定6次, 得到加標回收率和相對標準偏差（RSD）, 結果見表3。由表3可知, 12種PAEs的加標回收率為70. 8%～111%, RSD為0. 30%～7. 2%, 準確度和精密度均能滿足定量檢測要求。

表3 12種PAEs的平均回收率及相對標準偏差（n=6）Table 3 Mean recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 12 PAEs（n=6）

2.6 實際樣品檢測

采集當地市場隨機抽取的含乳飲料樣品共10批, 采用本方法進行前處理并檢測12種PAEs的含量。結果有4批次樣品檢出DMP、DIBP、DBP、DEHP、DINP, 檢 出 率 為40%, 含 量 為0. 83～49. 6μg/kg（見表4）；其余7種PAEs均未檢出。典型陽性樣品的色譜圖見圖3。我國GB 9685-2016《食品安全國家標準食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》中規定DEHP、DINP和DBP的最大殘留量分別為1. 5、9. 0、0. 3 mg/kg[11］, 因此上述10批次樣品為合格樣品。

表4 含乳飲料陽性樣品中PAEs的檢出結果（μg/kg）Table 4 Detected results of PAEs in positive milk beverage samples（μg/kg）

圖3 陽性樣品的色譜圖（樣品2）Fig. 3 Chromatograms for the positive sample（sample 2）

2.7 溫度及光照因素考察

對PAEs在不同溫度及光照下的遷移行為進行了研究, 以空白含乳飲料樣品（塑料瓶材質為PET）為例, 分別選取40、60、80℃避光及60 W光照4個條件, 在48 h內定期檢測樣品中12種PAEs的含量。結果表明, 80℃下短時間內DBP的遷移最為顯著, 最高遷移量達到7. 82μg/kg, 40℃和60℃下短時間內遷移并不明顯；值得注意的是, 60 W光照下, 短時間內DBP也產生了部分遷移（如圖4）。其他11種PAEs則未發現含量變化。我國食品安全標準GB 9685-2016規定[11］, PET材質包裝DBP的允許遷移量為0. 3 mg/kg, 本研究中DBP在48 h內的最大遷移量遠低于國家標準, 因此短時間內的高溫和光照下12種PAEs的污染風險較小。

圖4 不同溫度及光照下DBP的遷移量對比（n=3）Fig. 4 Comparison of DBP migration under different temperatures and lighting condition（n=3）

3 結 論

本文建立了檢測含乳飲料中12種PAEs的鹽析輔助液液萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法。與GB 5009. 271-2016國標方法[28］相比, 該方法的檢出限優于或達到現有國家標準, 檢測時間縮短10 min, 有機試劑用量減少, 成本大大降低, 且操作簡單快捷, 實用性強, 非常適合含乳飲料中PAEs含量的高通量檢測。此外, 部分PAEs在80℃或60 W光照下短時間內會微量從塑料瓶中遷移至飲料中, 因此瓶裝含乳飲料長時間存儲應避免高溫光照, 以降低污染風險。