水性涂料中半揮發性化合物的非靶向篩查及其潛在危害評估

馬洪生, 楊青華, 林勤保, 顏凌燕, 魏曉芬, 王 玥

（1. 珠海紅塔仁恒包裝股份有限公司, 廣東 珠海 519070；2. 暨南大學 包裝工程研究所, 廣東 珠海 519070）

自然纖維基紙和紙板材料及其制品能夠重復使用, 對環境影響較低, 而且紙包裝材料在食品供應鏈中能夠起到優良的包裝作用, 比如紙杯、紙碗等制品。傳統聚乙烯（PE）可通過淋膜工藝為紙制品提供更加優良的耐水耐油性能, 因此淋膜紙和紙杯廣泛應用于水、飲料等液體食品接觸材料[1-2］。而研究表明, 淋膜紙杯在90℃左右的熱水浸泡下, 會釋放出微塑料顆粒、重金屬等危害物質[3］, 可能產生潛在的安全風險。隨著可持續發展理念的深入和塑料污染治理的加強, PE涂層對環境的潛在影響同樣不可忽視。團體標準框架T/CPA 001-2021中介紹了一種水性涂層紙和紙杯, 該類紙制品具有可生物降解、回收再制漿等環境友好的優勢, 并能夠提供合適的耐水耐油和阻隔性, 同時《團體標準食品接觸用環保型涂布紙和紙板材料及制品》也處于公開征求意見階段, 食品接觸用水性涂層紙逐漸成為受到關注的新型食品接觸用紙[4］。

食品接觸用紙中存在超過六千多種物質可能遷移到食品中, 其中有意添加物（IAS）主要來源于各種功能性改性助劑, 而印刷油墨、粘合劑、涂層等加工原料, 以及生產過程中的污染物等可能引入非有意添加物（NIAS）[5-6］, 如鄰苯二甲酸酯、光引發劑等68種重點關注的污染物均能從食品接觸用紙和紙板材料中檢出[7］。而水性涂料借助多種聚合單體在引發劑和添加助劑的作用下, 發生乳液聚合作用從而形成聚合物涂層。前期研究表明, 水性涂料中的揮發性和半揮發性成分比較復雜, 這意味著水性涂料中的IAS和NIAS可能成為遷移到食品中的物質, 帶來食品安全隱患[8］。因此, 非靶向篩查水性涂料中的IAS和NIAS, 并對其潛在毒性風險進行預測評估, 顯得尤為重要。

本研究利用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對3種自然干燥水性涂料中的半揮發性化合物進行非靶向篩查, 結合MS-DIAL軟件、保留指數和NIST質譜庫進行定性分析, 并通過對部分結構相似化合物的半定量分析以及利用T. E. S. T軟件和VEGA QSAR軟件對不同毒性終點進行預測, 以評估物質的潛在毒性危害。

1 實驗部分

1.1 試劑與樣品

標準品：2-乙基己醇（純度99. 5%, 上海騰準生物科技有限公司）；二乙二醇二丁醚（純度99%）、2, 4-二叔丁基苯酚（純度98%）、甲基丙烯酸2-乙基己酯（純度99%）購于上海邁瑞爾化學技術有限公司；丙烯酸-2-乙基己酯（2-EHA, 純度＞99%）、鄰苯二甲酸二辛酯（純度99%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；苯乙烯（純度99. 5%）、甲醇（色譜純）購于上海麥克林生化科技有限公司；1 000 mg/L正構烷烴（C7～C40）混合標準溶液（色譜純, 上海安譜璀世標準技術服務有限公司）。

樣品：3種水性涂料樣品（編號為S1～S3）, 由珠海紅塔仁恒包裝股份有限公司提供。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫有限公司）；石英毛細管色譜柱DB-5MS（30 m×0. 25 mm×0. 25μm, 安捷倫科技有限公司）；TLE204E電子天平（準確等級I, 上海梅特勒-托利多有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準工作溶液配制標準儲備溶液：分別準確稱量0. 025 g各標準品（精確至0. 01 mg）于25 mL棕色容量瓶中, 用甲醇稀釋定容至刻度, 配制成質量濃度約為1 000 mg/L的混合標準儲備溶液, 置于4℃保存。標準工作溶液：分別用甲醇將混合標準儲備溶液逐級稀釋成一系列不同質量濃度的混合標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理分別準確稱量0. 50 g（精確至0. 01 g）水性涂料樣品于試管中, 自然放置干燥, 并記錄質量直至恒重, 樣品S1、S2、S3的固體含量分別為51. 67%、40. 55%和41. 85%。分別加入10 mL甲醇于各試管中, 超聲萃取30 min, 取清液過有機系尼龍微孔濾膜, 待GC-MS分析。

1.3.3 色譜與質譜條件GC條件：色譜柱：Agilent DB-5MS（30 m×0. 25 mm×0. 25μm）；溶劑延遲3 min。升溫程序：初始柱溫60℃, 以5℃/min升至150℃, 保持2 min；再以10℃/min升至300℃, 保持2 min。載氣（He, 純度＞99. 999%）, 流速為1 mL/min, 進樣量為1μL, 不分流進樣。

MS條件：電子轟擊（EI）離子源, 電離能量為70 eV, 離子源溫度為230℃；傳輸線溫度為275℃；全掃描（SCAN）模式, 掃描質量范圍為m/z 40～800；選擇離子（SIM）模式。

1.4 數據處理

通過MS-DIAL version 4. 90代謝組學軟件[9］對3種水性涂料樣品中的半揮發性化合物進行非靶向篩查, 通過保留指數、NIST質譜庫匹配提高物質定性的準確性[8］。其中, 軟件參數設置如下：離子化類型選擇“Hard ionization（GC/MS）”, 數據類型為“Centriod data”, 導入. CDF格式數據文件、. txt正構烷烴（C9～C27）保留時間文件和. msp質譜庫, 并設置樣品相關類型；MS質量數分析范圍為40～800 Da, 容差值為0. 5 Da, 最小分析峰高為2 000, 保留指數相似度容差為20%, 保留時間容差為0. 5 min, EI碎片離子峰的相似度不低于80%。為增加定性準確性, 分別人工檢查MS-DIAL峰對齊結果（綜合得分）和GCMS工作站中NIST MS search檢索結果（EI相似度、頻率）, 篩選并手動注釋準確的定性物質信息。

為確定檢出物質的用途和功能, 以及后續毒性預測評估, 分別在物質限制清單、法規和相關數據庫, 如Pubchem（https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov）數據庫、高度關注物質清單（SVHC）、REACH清單（https：//echa. europa. eu/home）、有害空氣污染物（HAPs）、特定遷移限量（SML）等[10-11］, 檢索定性物質的信息, 包括CAS號（或NIST#）、SMILES等。利用Origin 2021和IBM SPSS Statistics 25進行相應圖形繪制和數據處理分析。

2 結果與討論

2.1 方法學驗證

2.1.1 線性方程與檢出限采用本方法對7種目標化合物的系列混合標準工作溶液進行測定, 分別以目標物的質量濃度（X）為橫坐標, 峰面積（Y）為縱坐標, 擬合線性回歸方程。由表1可知, 目標物在不同質量濃度范圍內具有良好的線性關系, 相關系數（r2）均不低于0. 974 7。分別以基線平均噪音的3倍和10倍對應的目標物質量濃度作為方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）, 結果顯示, 除響應較低的二乙二醇二丁醚外, 其余6種化合物的檢出限為0. 29～42. 86μg/L, 定量下限為0. 97～142. 86μg/L, 基本滿足定量檢測的靈敏度要求。

表1 目標物質的線性關系、檢出限及定量下限Table 1 Linear relations, LODs and LOQs for targeted analytes

2.1.2 加標回收率與相對標準偏差采用甲醇分別配制低、中、高3個不同濃度水平的目標物質標準溶液, 并按照與樣品相同的超聲提取條件處理后, 測定目標物質濃度, 計算回收率和相對標準偏差（RSD）, 以驗證方法的準確度和精密度, 每個加標濃度平行測定6次。由表2可知, 目標物質在3個加標水平下的平均回收率為85. 2%～118%, RSD為1. 3%～11%, 表明該方法基本滿足定量分析要求。

表2 目標物質的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs of targeted analytes（n=6）

2.2 水性涂料中半揮發性物質的初步識別

利用甲醇超聲提取自然干燥至恒重的水性涂料樣品中的半揮發性化合物, 其總離子流圖（TIC）如圖1所示。由圖可知, 相較于樣品S2和S3, S1的物質組成更復雜, 在20 min后S1中出現更多的色譜特征峰, 而在20 min前, 3種樣品的特征峰均較少, 可檢出2-乙基己醇、丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯等部分物質。

圖1 3種涂料樣品（S1、S2和S3）中半揮發性化合物的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms（TIC）of semi-volatile organic compounds extracted from three coating samples（S1, S2 and S3）

通過MS-DIAL峰對齊處理將部分重疊峰進行解卷積, 3種涂料樣品和空白溶劑中共檢出139個色譜特征峰（峰高大于2 000）, 借助保留指數匹配和NIST MS search分析, 可初步定性出僅來自于涂料樣品中的63種半揮發性化合物。參考NIST MS search軟件對化合物識別分類, 可將上述物質分為7種芳香烴化合物、9種羰基化合物、13種酯基化合物、6種碳氫化合物、9種羥基化合物以及19種具有多種官能團或無明確分類的其他化合物。其中, 3種涂料樣品中各類化合物的分布情況如圖2A所示, 除了羥基化合物, 樣品S1中其余幾種化合物的數量均較多, 且這些化合物的總峰面積（圖2B）與數量表現出相同的規律, 可說明樣品S1中物質更加復雜。

圖2 3種涂層樣品（S1、S2、S3）中化合物的類別分布（A）及其總峰面積（B）Fig. 2 Classes distribution（A）and total peak area（B）of chemicals from three coating samples（S1, S2 and S3）

樣品S1中檢出的芳香烴類物質主要為苯乙烯和α-甲基苯乙烯（即2-苯丙烯）, 平均相對峰面積分別為1. 02%和1. 84%, 而在樣品S2中兩者的相對峰面積略高, 分別為2. 67%和1. 88%。由圖2B可知, 樣品S1中芳香烴化合物的總峰面積更高, 其中苯乙烯和α-甲基苯乙烯的峰面積比樣品S2中的更高, 而這兩種物質在樣品S3中未檢出。從Pubchem數據庫可知, 苯乙烯和α-甲基苯乙烯在多種食品接觸材料中被檢出, 同時在涂料中還能作為丙烯酸酯類乳液涂料的共聚單體, 替代部分丙烯酸酯類單體的作用, 降低涂料粘度并形成涂層[12］, 說明苯乙烯和α-甲基苯乙烯可能作為乳液類涂料樣品中的有意添加聚合單體物質。

醛類、酮類和羧酸類化合物被歸類為羰基化合物, 樣品S1中羰基化合物的總峰面積遠高于其他樣品。其中, 苯乙酮常用于花香特征的風味物質, 同時還能作為光敏劑。軟脂酸可用于制造棕櫚酸鹽, 而棕櫚酸金屬鹽（如鈉鹽）可在水性乳液涂料中起到乳化劑、表面活性劑的作用, 該物質未在樣品S3中檢出。

含有酯基結構的化合物在樣品S1中的相對總峰面積為34. 68%, 其中, 丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸異辛酯和甲基丙烯酸-2-乙基己酯, 可能是作為丙烯酸酯乳液的聚合單體；在樣品S2和S3中也主要檢出了甲基丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸異辛酯等單體物質, 推測上述3種涂料樣品是水性丙烯酸酯乳液型涂料, 這與前期的研究發現相同[8］。此外, 樣品中檢測到不同峰面積的鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二辛酯2種增塑劑, 盡管鄰苯二甲酸二丁酯可起到消泡作用, 增加乳液流平性能, 但該類物質已被列入SVHC清單并受到REACH管控限制, 其潛在安全性不容忽視。棕櫚酸甲酯和硬酯酸甲酯對3種涂料樣品中酯基結構化合物的檢出均起到主要貢獻作用, 是常見表面活性劑生產的中間體。此外, 間苯二甲酸二甲酯等酯類物質僅在樣品S1中檢測到。

而在羥基化合物中主要包括醇類物質和酚羥基結構物質, 如2-乙基己醇、月桂醇、十四醇以及2, 4-二叔丁基苯酚等。樣品S1中2-乙基己醇的峰面積最大, 2-乙基己醇是具有愉悅花草香的風味劑, 可能來源于醇類溶劑殘留, 或是干燥涂膜中丙烯酸-2-乙基己酯或甲基丙烯酸-2-乙基己酯聚合單體的斷裂產物。此外, 2, 4-二叔丁基苯酚的相對峰面積占樣品S1中化合物相對峰面積的6. 06%, 該物質常用于合成紫外吸收劑、增塑劑等。2, 2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）是食品接觸材料中常檢出的添加劑, 其在上述3種涂料樣品中均可檢出, 在乳液或粘合劑中起到抗氧化、穩定的作用。值得注意的是, 僅在樣品S2中檢出的月桂醇、十四醇和十六醇, 能用于有機合成乳化劑、消泡劑等表面活性劑, 例如月桂醇硫酸鈉（SDS）是用于乳液涂料的陰離子表面活性劑。2-乙基己醇、月桂醇等物質則可能是水性涂料中重要的NIAS。此外, 2, 4, 7, 9-四甲基-5-癸炔-4, 7-二醇是常用于涂料的炔烴類表面活性劑, 三乙二醇單丁醚能夠用作部分添加劑的助溶劑, 并能與水溶液互溶形成水性體系, 這兩種物質均只在樣品S3中檢出。

2.3 半揮發性物質的潛在危害評估

對部分具有準確結構和相似結構的物質進行準確定量或半定量分析, 并基于兩種構效關系（SAR）工具, T. E. S. T軟件（https：//www. epa. gov/chemical-research/toxicity-estimation-software-tool-test）和VEGA QSAR（https：//www. vega-qsar. eu/）軟件, 對非靶向篩查物質的不同毒性終點進行預測評估, 包括急性毒性、發育毒性、致癌致突變性等[13-14］。

使用T. E. S. T軟件和共識預測法可對各化合物的發育毒性、致突變性和小鼠半數致死量（LD50）進行預測。共識法能夠對分層法、單模型法等方法的預測結果求取平均值, 從而實現更好的預測可信度, 用于預測評估物質毒性[15］；利用VEGA QSAR軟件對上述毒性終點進行預測分析, 將物質的不同毒性終點預測結果進行分類描述。此外, 還利用VEGA QSAR軟件對致癌性、Cramer等級進行分析。基于物質毒性和結構間的假設關系, 可通過Cramer決策樹將化合物分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3類, 對應的毒理學關注閾值（TTC）分別為30、9、1. 5μg/kg bw/d。

對于發育毒性和致突變性等級分類, 將在兩種軟件中預測為共識陽性結果的物質標記為ClassⅠ, 均為陰性的物質標記為ClassⅢ, 其余預測情況為ClassⅡ；而對于LD50, 將兩種軟件中預測致死劑量均大于5 000 mg/kg的物質標記為ClassⅢ, 將任一軟件預測致死劑量小于500 mg/kg的物質標記為ClassⅠ, 其余預測情況均為ClassⅡ。

由63種半揮發性化合物的危害評估結果（如圖3）可知, 兩種軟件預測均具有發育毒性、致突變和LD50陽性的化合物數量分別為21、11和4種, 說明這些物質的預測結果更加準確且潛在風險較高（圖3A）。其中, 含有Cl、N和Si等元素的化合物, 均具有陽性的致癌致突變作用和發育毒性, 如氯代十二烷、秋水仙胺、硅氧烷等。其中硅氧烷可能是來源于聚丙烯酸乳液中的改性劑, 而其他物質主要是NIAS或存在錯判可能的物質。其中, 大部分物質（43種）不具有致突變陽性作用。由圖3B可知, 26種化合物被歸類為CramerⅢ, 對應的毒理學關注閾值TTC=1. 5μg/kg bw/d, 這些化合物同樣包括含有Cl、N和Si元素的物質, 以及一些含有苯環等結構的物質。由圖3C可知, 28種物質表現為致癌陽性, 主要包括烴類物質和部分醇類物質。

圖3 3種涂料樣品中63種半揮發性化合物的危害預測評估結果Fig. 3 Potential hazard assessment results of 63 semi-volatile compounds from three coating samples

對某些具有相似結構或具體功能用途的物質進行（半）定量分析（表3）。其中, 2, 4-二叔丁基苯酚、2-甲基-1-萘酚、2, 2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）和2-乙基己醇等物質表現出發育毒性, 可能對人類發育產生不良影響。2-乙基己醇可能來源于丙烯酸酯類單體的斷鏈過程, 該物質所規定的特定遷移限量為30 mg/kg, 而其在3種涂料樣品中均具有較高的含量, 特別是在樣品S1中含量達707. 37 mg/kg。除了間苯二甲酸二甲酯表現出發育毒性陽性, 樣品中大部分酯類化合物的毒性風險不高。常見丙烯酸酯類單體被規定特定遷移總限量不得超過6 mg/kg, 其中丙烯酸-2-乙基己酯的特定遷移限量不能超過0. 05 mg/kg, 而在研究樣品中丙烯酸酯類物質作為有意添加的聚合單體物質, 檢出含量較高, 如丙烯酸-2-乙基己酯在樣品S1中的含量最高為150. 87 mg/kg。當用于食品接觸時, 很有可能遷移到食品中。此外, 僅在樣品S1和S2中檢測到的苯乙烯和α-甲基苯乙烯, 表現出致突變陽性和致癌陽性, 苯乙烯還被列為HAPs物質清單, 即有害空氣污染物, 對人體具有一定刺激作用, 甚至引起不適癥狀。目前暫無明確規定苯乙烯作為非有意添加物質的遷移限量要求, 而α-甲基苯乙烯被規定特定遷移量不得超過0. 05 mg/kg。此外, 樣品S3中三乙二醇單丁醚的檢出含量較高, 為1 616. 28 mg/kg, 其預測結果僅表現為致癌陽性。其他可能作為IAS的物質, 如表面活性劑2, 4, 7, 9-四甲基-5-癸炔-4, 7-二醇、月桂醇等, 其部分毒性端點的預測風險較低。

表3 3種樣品中可量化物質的含量及其毒性危害評估Table 3 Contents and toxic hazard assessment of some quantifiable substances in three samples

（續表3）

（續表3）

3 結 論

本文通過GC-MS對3種水性涂料樣品中的半揮發性化合物進行非靶向篩查后, 利用MS-DIAL軟件結合保留指數和NIST質譜庫定性, 初步得到包括芳香烴化合物、羰基化合物、酯基化合物以及具有多種官能團的63種化合物。3種涂料樣品中作為有意添加的聚合單體主要為丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯和丙烯酸異辛酯, 并檢出不同含量的苯乙烯、α-甲基苯乙烯共聚單體、2, 4, 7, 9-四甲基-5-癸炔-4, 7-二醇消泡劑和三乙二醇單丁醚助溶劑等有意添加物質。對部分相似結構的化合物進行半定量分析, 并利用T. E. S. T和VEGA QSAR軟件進行潛在的毒性風險預測評估。部分含有Cl、N、Si元素的化合物, 以及絕大多數非有意添加物質, 如2-乙基己醇、間苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二辛酯等, 在不同毒性終點預測結果中表現為發育毒性、致癌致突變陽性或較低毒理學關注閾值, 而除了苯乙烯和α-甲基苯乙烯之外, 丙烯酸酯類聚合單體和某些添加助劑等IAS, 并未表現出毒性陽性風險。基于以上分析, 今后應進一步評估水性涂層中遷移物的安全風險, 為水性涂層紙的食品接觸使用提供參考依據。