高效液相色譜法用于黃體酮注射液的含量測定*

黃孟秋，盧瑞芯，黃澤丹，王涌杰，陳紅英

(廣州白云山明興制藥有限公司，廣東 廣州 510250)

黃體酮(Progesterone，又稱孕酮)，由孕二醇在黃體生成激素作用下轉化成，是臨床常用的孕激素類藥物，已被廣泛應用于各種婦科疾病。黃體酮的荷爾蒙作用是在1929年被發現的，1934年Willard Allen分離出純凈結晶的黃體酮，并與哥倫比亞大學的Wintersteiner在實驗室共同測定了其化學結構，將其命名為Progesterone。同年下半年，黃體酮實現了的化學合成，開始被用于臨床研究。目前臨床上常用的黃體酮制劑主要有口服、注射和陰道給藥三種給藥途徑，肌內注射是最普遍的形式[1-2]。用于肌內注射的黃體酮注射液的適應癥為，用于月經失調，如閉經和功能性子宮出血、黃體功能不足、先兆流產和習慣性流產(因黃體不足引起者)、經前期緊張綜合癥的治療[3-4]。《中國藥典》2020年版中黃體酮注射液含量測定的前處理環節復雜，采用了提取、復溶、離心等方法，整個過程操作繁瑣，影響因素較多，尤其是該方法需要將乙醚提取液置具塞離心管中，在溫水浴中使乙醚揮散，因乙醚的沸點僅為 34.6 ℃，置離心管中揮發，有爆沸的可能，容易發生意外導致火災，實際操作中對操作人員而言有較大的風險[5]。結合文獻[6-8]，本研究改進了黃體酮注射液含量測定中供試品的前處理方法，大幅簡化了藥典方法中復雜的前處理環節，更適用于黃體酮注射液的含量測定。

圖1 黃體酮化學結構Fig.1 Chemical structure of progesterone

1 儀器與材料

1.1 儀 器

LC-2030 PLUS高效液相色譜儀；梅特勒托利多XS105電子天平；天津市泰斯特儀器有限公司DK-98-II電熱恒溫水浴鍋；AXTG16G高速離心機。

1.2 試 藥

乙腈(色譜純，批號：2020AH006)，康科德；甲醇(色譜純，批號：2020MH008)，康科德；水為實驗室制備超純水；黃體酮對照品(批號：100027-201810，含量：99.6%)，中國食品藥品檢定研究院；黃體酮注射液(規格：1 mL:10 mg，共10個批次)，實驗室自制;精制芝麻油(批號：19C3607，SIO，注射級)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm色譜柱)；流動相：水-乙腈(50∶50)等度洗脫；流速：1.5 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：241 nm；柱溫：30 ℃；溶劑為甲醇，進樣前溶液均用0.45 μm孔徑尼龍濾膜過濾。

2.2 對照品溶液的制備

取黃體酮對照品約20 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為黃體酮儲備液 (0.40 mg/mL)。分別精密量取黃體酮儲備液2 mL、4 mL、 5 mL、6 mL、7 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備得到黃體酮濃度約為16、32、40、48、56 μg/mL的對照品溶液。其中40 μg/mL濃度的對照品溶液作為含量測定用的對照品溶液。

2.3 供試品溶液及陰性對照溶液的制備

精密量取本品2 mL(約相當于黃體酮20 mg)，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取供試品溶液5 mL，至50 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取精制芝麻油2 mL，按上述方法操作，即得陰性對照溶液。

2.4 專屬性試驗和系統適應性試驗

分別對陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液進行分析，考察樣品中輔料對黃體酮定量的干擾，根據圖2所示，樣品中輔料不干擾黃體酮的測定。理論塔板數按黃體酮計算不低于4000。

圖2 專屬性試驗色譜圖Fig.2 Specificity test chromatogram

2.5 線性范圍

對“2.2”項不同濃度的對照品溶液分別進樣，以峰面積為縱坐標，濃度(μg/mL)為橫坐標作標準曲線。得到黃體酮的線性方程為Y=23372030.79X-81485.62，線性相關系數(r)為0.9998，線性范圍16.05～55.98 μg/mL，說明方法在該范圍內，線性關系良好，符合規定。

圖3 線性結果Fig.3 Linearity results

2.6 精密度試驗

2.6.1 重復性試驗

采用批號為20200717的黃體酮注射液作為供試品，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，分別進樣分析，計算得到黃體酮含量的RSD(n=6)為0.85%，說明方法的重復性良好。

2.6.2 中間精密度試驗

照2.6.1重復性試驗方法于不同日期、不同儀器，由不同操作人員，對同一批樣品進行含量測定，重復操作6次。6次含量結果的RSD為0.52%，小于2.0%；12次含量結果的RSD為1.03%，小于2.0%，符合要求。

2.7 準確度

分別精密稱取黃體酮對照品各約8 mg、10 mg、12 mg，置不同25 mL量瓶中，按照處方量精密加入芝麻油約0.907 g(相當于芝麻油1 mL)，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別作為80%、100%、120%加標供試品溶液。同法配制三份，共九份樣品，進樣測定，結果顯示，黃體酮的平均加樣回收率為 100.2%(n=9)，RSD為0.79%(n=9)，表明方法的加樣回收率良好。

表1 準確度試驗結果Table 1 Accuracy test results

2.8 溶液穩定性試驗

取對照品溶液及供試品溶液于室溫避光條件下放置，于 0～48 h，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察其溶液穩定性。溶液如在初步擬定的時間或條件內不穩定，可縮短考察時間及改變放置條件。

表2 溶液穩定性試驗結果Table 2 Solution stability test results

對照品溶液中，在48 h內的主峰面積變化率最大為1.38%，小于2.0%，即對照品溶液在48 h內穩定；供試品溶液中，在24 h內的主峰面積變化率最大為1.45%，小于2.0%，即供試品溶液在24 h內穩定，在48 h內的主峰面積變化率最大為2.02%大于2.0%，即供試品溶液在48小時內不穩定。

2.9 樣品含量測定

表3 十個批次黃體酮注射液含量測定結果Table 3 Ten batches of progesterone injection content determination results

采用本研究建立的含量測定方法及2020版中國藥典的方法，對實驗室制備得到的十個批次的黃體酮注射液進行含量測定，每個樣品制備供試品溶液2份，含量測定的結果取平均值，測定結果顯示該方法與藥典方法含量測定結果一致，說明方法準確可靠，用于黃體酮注射液的含量測定具備可行性。結果如表3所示。

3 結 論

3.1 提取過程更簡便

藥典方法選擇乙醚作為提取溶劑，需要將乙醚水浴揮散后甲醇復溶提取物，并需要通過多次振搖后離心的方式去除溶解在乙醚而不溶于甲醇的輔料成分，操作相對繁瑣；本實驗采用甲醇溶解黃體酮，操作簡單，盡可能減少操作中引入的誤差及減少輔料中的成分對黃體酮含量測定時的干擾。

3.2 檢驗過程更安全

避免乙醚提取液置離心管中揮發，降低試驗風險，避免因意外導致火災，實際操作中對操作人員而言更安全。

3.3 實驗過程更快捷

藥典方法需要用甲醇振搖4次(5、5、5、3 mL)復溶黃體酮乙醚提取物，每次需振搖10 min，之后還需離心15 min，處理一份樣品共計100 min。本實驗處理一份樣品僅需5 min，相對而言處理過程更快捷。

3.4 含量測定結果準確可靠

本實驗在保證檢測波長241 nm與藥典方法一致的前提下，對供試品前處理方法加以優化，結果顯示該方法與藥典方法含量測定結果一致，說明方法準確可靠，可用于黃體酮注射液的含量測定。