單分散二乙二醇羧酸衍生物的工藝優(yōu)化和雜質(zhì)研究*

李 虎，張安林， ，許 慧，成 佳，馬 寧

(1 湖南華騰制藥有限公司，湖南 長沙 410006；2 長沙創(chuàng)新藥物工業(yè)技術(shù)研究院有限公司，湖南 長沙 410006；3 長沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 湖南 長沙 410219)

隨著化學(xué)工業(yè)和醫(yī)藥研發(fā)的飛速發(fā)展，全球范圍內(nèi)對(duì)藥品的質(zhì)量要求也水漲船高，使用多分散性的PEG修飾的藥物分子已經(jīng)逐漸不能滿足生物醫(yī)藥市場對(duì)藥物的高質(zhì)量需求。而使用具有單一成分的單分散PEG代替多分散PEG是解決這一困難的行之有效的途徑。單分散PEG的合成方法主要分為四類：單端延伸法、雙端延伸法、鏈單端倍增法以及鏈雙端倍增法。它們的合成純度很高，但分子量越高的PEG的官能團(tuán)化往往步驟較長，并且純化都十分困難[8-10]。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的單分散PEG合成方法一般在鏈延長和官能化過程中存在較為復(fù)雜的保護(hù)/脫保護(hù)過程，并且分離純化需要通過柱層析方法，為了除去同系物雜質(zhì)往往會(huì)降低分離速度以致合成效率降低。

單分散PEG是目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中使用越來越多的藥物修飾劑，適用于單抗等生物大分子修飾的單分散PEG具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。單分散PEG的官能團(tuán)化，能夠?yàn)樯镝t(yī)藥以及材料科學(xué)提供諸多十分有價(jià)值的中間體[11-13]。所以開發(fā)一系列高效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的單分散PEG的制備方法來滿足生物藥的快速發(fā)展已經(jīng)迫在眉睫。本文研究了二乙二醇雙官能團(tuán)化乙酸的合成方法，其工藝如圖1所示，同時(shí)開發(fā)出一套衍生化分析方法對(duì)其純度和雜質(zhì)進(jìn)行了分析表征。

圖1 二乙二醇雙羧酸的合成工藝Fig.1 Synthesis of diethylene glycol dicarboxylic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

400 MHz牛津中科高分辨核磁共振波譜儀；Waters e2695型高效液相色譜；二乙二醇,陶氏化學(xué)(中國)有限公司；溴乙酸叔丁酯,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸,科隆化學(xué)品有限公司；其他常用試劑規(guī)格均為市售分析純。

1.2 CM-PEG2-CM 3的合成

堿A為40%氫氧化鈉溶液(40%NaOH aq.)，固體氫氧化鈉(NaOH)，氫化鈉(NaH)，叔丁醇鉀(t-BuOK)，1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)中的一種。溶劑B為四氫呋喃(THF)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)， N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一種。

將10 g(0.094 mol，1 eq)二乙二醇加入到500 mL反應(yīng)瓶中，加入200 mL溶劑B，于20 ℃攪拌下加入堿A(3 eq)，然后滴加溴乙酸叔丁酯40 g(0. 207 mol，2.2 eq)，反應(yīng)體系繼續(xù)攪拌12 h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束。加入150 mL水，然后用乙酸乙酯200 mL×2萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，將有機(jī)相減壓蒸除溶劑得到粗品，粗品經(jīng)柱層析純化后得到化合物2。1H NMR(400 MHz， CDCl3) δ 4.02(s， 1H)， 3.79～3.63(m， 1H)， 1.47(s， 1H)。

將2(10 g)加入到100 mL反應(yīng)瓶中，加入4 M鹽酸溶液，反應(yīng)體系升溫至65 ℃，攪拌6 h。冷卻至室溫，加入50 mL乙酸乙酯洗滌一次，再用50 mL二氯甲烷洗滌一次。減壓蒸除水分，得到6 g產(chǎn)品CM-PEG2-CM(3)，淡黃色粘稠液體，收率：90%。1H NMR(400 MHz， D2O) δ 4.14(s， 1H)， 3.66(d，J=7.9 Hz， 1H)。

1.3 CM-PEG2-CM的衍生化分析方法

將22.2 mg的CM-PEG2-CM溶解在1 mL二氯甲烷中，加入64.5 mg的DIPEA，充分?jǐn)嚢韬缶徛渭?9.8 mg的 SOCI2溶液(溶解在2 mL二氯甲烷中)攪拌2 h。然后將42.8 mg芐胺加進(jìn)反應(yīng)體系繼續(xù)反應(yīng)30 min，結(jié)束后將反應(yīng)液用乙腈轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，定溶至100 mL后直接進(jìn)樣進(jìn)行HPLC檢測分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿和溶劑對(duì)化合物2收率的影響

二乙二醇與溴乙酸叔丁酯通過親核取代反應(yīng)獲得化合物2，該步反應(yīng)是整個(gè)反應(yīng)的最重要步驟，反應(yīng)的收率和所得化合物2的純度將對(duì)產(chǎn)品3的質(zhì)量產(chǎn)生決定性影響。然而由于溴乙酸叔丁酯的亞甲基氫較為活潑，導(dǎo)致溴乙酸叔丁酯參與的親核取代反應(yīng)普遍由于副反應(yīng)而導(dǎo)致收率極低[14]，而見諸報(bào)道的親核試劑經(jīng)常選擇氫化鈉，并且氫化鈉用量往往較大，氫化鈉的易燃性決定了該反應(yīng)體系存在重大安全隱患而無法實(shí)現(xiàn)規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，所以篩選合適的親核反應(yīng)體系對(duì)于化合物3的產(chǎn)業(yè)化意義重大。為了篩選最佳的反應(yīng)條件，對(duì)反應(yīng)使用的堿和溶劑做了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，從表2中看出使用氫化鈉做堿和NMP作為溶劑可以得到最高的收率為35%，將氫化鈉替換成普通的堿NaOH后，中間體2的收率達(dá)到了32%。雖然比氫化鈉參與的反應(yīng)收率低一些，但是安全性獲得極大優(yōu)化。

表2 堿和溶劑對(duì)收率的影響Table 2 Influence of alkali and solvent on yield

2.2 堿和溶劑對(duì)雜質(zhì)的影響

在產(chǎn)品3的工藝質(zhì)量控制方面，一方面是產(chǎn)品收率，另一方面更重要的是雜質(zhì)鑒定和控制。我們對(duì)表1所述條件下的所有批次產(chǎn)物進(jìn)行了HNMR、LC-MS以及衍生化HPLC分析。發(fā)現(xiàn)各條件下獲得的化合物3的HNMR圖譜基本沒有區(qū)別，但是如圖2所示LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，條件1～15對(duì)應(yīng)獲得的產(chǎn)品3均除了有目標(biāo)特征離子峰223.2 m/z之外，還或多或少出現(xiàn)了一個(gè)明顯的雜質(zhì)離子峰281.0 m/z。我們推測該雜質(zhì)對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式如圖2中所示的3a，它是合成工藝中第一步反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物2a經(jīng)水解得到的。

圖2 產(chǎn)品3的LC-MS分析圖譜Fig.2 LC-MS analysis of product 3

我們選取部分條件下得到的產(chǎn)品3進(jìn)行芐胺衍生化HPLC分析，結(jié)果如圖3所示。產(chǎn)品3的芐胺衍生物保留時(shí)間在16.1 min，而所有條件下獲得的產(chǎn)品3的衍生化主要涉及兩個(gè)雜質(zhì)，保留時(shí)間分別在14.9 min和17.3 min。14.9 min經(jīng)分析是產(chǎn)品3的單芐胺衍生物，是衍生化不完全造成的，故14.9 min對(duì)應(yīng)的衍生化雜質(zhì)可以忽略，而17.3 min對(duì)應(yīng)的是雜質(zhì)3a的芐胺衍生物，很明顯該雜質(zhì)與主峰保留時(shí)間十分接近，對(duì)應(yīng)的雜質(zhì)3a在產(chǎn)品3中亦很難實(shí)現(xiàn)純化分離。從圖3a和圖3b中可以看出，40% NaOH條件下對(duì)應(yīng)獲得的產(chǎn)物3中會(huì)出現(xiàn)大量雜質(zhì)3a(6.2%)，而此雜質(zhì)在95%NaOH條件下對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)明顯減少(1.32%)，同時(shí)在其它堿作為親核試劑條件下對(duì)應(yīng)產(chǎn)品中的該雜質(zhì)含量均低于0.5%(圖3c～g)。我們推測是反應(yīng)步驟1中，由于有水的存在，反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生雜質(zhì)2a，此雜質(zhì)在化合物2的檢測中難以發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)水解步驟后產(chǎn)生雜質(zhì)3a，3a與產(chǎn)品3的理化特征幾乎一模一樣，難以鑒別，同時(shí)無法通過常規(guī)方法將3a從產(chǎn)品3中分離除去。而使用氫化鈉和叔丁醇鉀對(duì)應(yīng)得到的產(chǎn)品之所以含有的雜質(zhì)較少(圖3d～e)，主要是因?yàn)闅浠c和叔丁醇鉀可以和水發(fā)生反應(yīng)，從而起到對(duì)反應(yīng)體系除水的目的，相應(yīng)產(chǎn)生較少的雜質(zhì)。圖3a～b圖譜對(duì)應(yīng)的工藝使用氫氧化鈉水溶液作為堿，中間體2以及過量的溴乙酸叔丁酯會(huì)在堿性條件下部分水解，水解產(chǎn)物之間再次發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生雜質(zhì)中間體2a，并在后續(xù)反應(yīng)中水解為雜質(zhì)3a。工藝中水的存在不僅影響產(chǎn)物純度也極大降低產(chǎn)物收率。可見該工藝的關(guān)鍵雜質(zhì)控制條件為水分，即需要在嚴(yán)格無水條件下才能獲得高純度的產(chǎn)品3。

圖3 產(chǎn)品3的芐胺衍生化HPLC分析圖譜Fig.3 HPLC analysis of benzylamine derivatization of product 3

2.3 溫度對(duì)化合物2收率的影響

由于工藝步驟中反應(yīng)條件氫氧化鈉與氫化鈉對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物收率相當(dāng)，但在安全性和產(chǎn)業(yè)化前景上，氫氧化鈉比氫化鈉更具有優(yōu)勢。所以反應(yīng)條件上選擇固體氫氧化鈉作為最佳條件，在嚴(yán)格控制反應(yīng)體系水分的基礎(chǔ)上研究了溫度對(duì)反應(yīng)的影響。從表3中看出在25 ℃和35 ℃條件下核心中間體2的收率基本沒有變化，但隨著溫度的進(jìn)一步升高，收率明顯減少。所以此反應(yīng)的溫度在25～35 ℃為宜。

表3 NaOH反應(yīng)條件下溫度對(duì)收率的影響Table 3 Effect of temperature on yield under reaction condition NaOH

3 結(jié) 論

本文以二乙二醇和溴乙酸叔丁酯為原料，通過對(duì)反應(yīng)條件的篩選，確定最優(yōu)反應(yīng)條件為固體氫氧化鈉為堿，N-甲基吡咯烷酮為反應(yīng)溶劑，25～35 ℃為反應(yīng)溫度，制得二乙二醇雙羧酸衍生物，并對(duì)其做了表征。該工藝安全可靠，產(chǎn)品雜質(zhì)含量較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。