不同配比的黃芪-當歸藥對體外抗氧化性實驗研究*

姜歡歡，周亞明，王禮豐，方歡樂

(西安培華學院醫學院，陜西 西安 710125)

中醫多以數味中藥配伍形成的方劑為載體治療疾病。配伍是中藥用方的靈魂。藥有個性之特長，方有合群之妙用，藥物的聯合使用才能產生藥物的相互作用，主要表現在效應的強度、毒性以及作用時間上的變化。兩藥配伍后可產生相加性、協同性或拮抗性藥物相互作用。復方中藥是近年來研究的熱點，其成分復雜、靶點眾多，而藥對是復方的重要核心及最佳切入點，黃芪-當歸藥對便是其中的一員[1]。

黃芪當歸藥對在我國已有近千年的使用歷史，在許多復方試劑中黃芪和當歸作為常用藥物頻繁出現，被廣泛用于心血管系統、血液系統、消化系統、呼吸系統、免疫系統和泌尿系統疾病的治療[2]。關于其配伍比例歷代記載不盡相同，最早記載于《陳素庵婦科補解·調經門》，方中黃芪與當歸之比為 5∶6，黃芪用量少于當歸用量[3]。金元時期“當歸補血湯”名揚天下，史載于《內外傷辨惑論·暑傷胃氣論》，方中當歸用量少于黃芪，1∶5的歸芪比沿用至今[4]。

陳芳等[5]從中醫方劑數據庫中檢索出含有當歸、黃芪的2632首方劑，建立數據庫，研究當歸黃芪配比狀況數據后發現，當歸與黃芪在方劑中出現的配比關系主要有52種，可歸納為3種情況。(1)當歸<黃芪量：據統計，當歸與黃芪以此配伍比例出現在方劑中的數目為874個，其中比例在1∶2和2∶3處最為集中，分別為288和146個。所占頻率分別為32.95%和16.7%。(2)當歸量=黃芪量：當歸與黃芪以此配伍比例出現在方劑中的數目為1301個，此配伍比例在方劑中出現的概率最大，為49.43%。(3)當歸量>黃芪量：當歸與黃芪以此配伍比例出現在方劑中的數目為457個，其中配伍比例在2∶1，3∶2，5∶3處出現最多，分別為103，68，60個。所占頻率分別為22.54%，14.88%，13.13%。

統計見圖1所示。

圖1 黃芪與當歸在方劑中出現的配比關系數目Fig.1 Number of proportion relations between Astragalus membranaceus and Angelica sinensis in the formula

本文結合文獻研究黃芪-當歸藥對9種不同配伍比例、6種不同濃度體外抗氧化性的強弱，篩選其中抗氧化最強配比。為臨床用藥提供依據，同時也為經典名方當歸補血湯研究開發提供實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

黃芪、當歸購自于西安藻露堂大藥房。黃芪為膜莢黃芪Astragalusmembranaceu(sFisch.)Bunge的干燥根，當歸為傘形科植物當歸 Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根。

1.2 實驗儀器

TE124S電子天平；DC-3010電子恒溫電浴鍋；RE-52AA旋轉蒸發器；SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵；SpectraMax M2 多功能全自動酶標儀；96孔細胞培養板；微量移液器；CS501 型超級恒溫水浴鍋；KQ-50DB超聲清洗器。

1.3 藥品試劑

95%乙醇、甲醇、抗壞血酸、過硫酸鉀(K2S2O8) 、1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺(ABTS)三吡啶三吖嗪(TPTZ)。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品的制備

精密稱取配比中當歸 ∶黃芪的量約共12 g，將藥材倒入250 mL錐形瓶中，加10倍量的乙醇-水(70+30)恒溫加熱，控制溫度在90 ℃，提取30 min，用濾紙將提取液過濾至燒杯中，濾渣再加10倍量乙醇-水(70+30)，在同樣條件下加熱過濾。合并濾液后用雙層濾紙抽濾一次，濾液置旋轉蒸發器中濃縮，最后用乙醇-水(70+30)定容于 50 mL 容量瓶中，此時當歸-黃芪質量濃度為 240.00 g/L。將提取液分別配置成含藥材9.60 g/L，19.20 g/L，24.00 g/L，28.80 g/L，48.00 g/L，120.00 g/L的六種濃度溶液，置于4 ℃下冷藏備用。

1.4.2 清除DPPH自由基試驗

在96孔板中加入6種不同濃度的樣品液20 μL，再分別加入100 μLDPPH溶液，最后加甲醇80 μL至每個檢測孔為200 μL，避光靜置30 min。另將DPPH溶液換為甲醇溶液，重復上述操作，以甲醇做空白對照。每份樣品平行操作3次，取平均值。利用多功能酶標儀震蕩5 s，測定519 nm處的A值，計算DPPH的清除率。

式中：As為樣品+DPPH溶液;Ab為樣品+甲醇溶液;Ac為DPPH溶液;Ab′為甲醇溶液。

1.4.3 清除ABTS自由基試驗

在96孔板中分別加入六種不同濃度的樣品液20 μL再分別加入100 μL ABTS工作液，最后加甲醇80 μL至每個檢測孔為200 μL，室溫下孵育6 min。利用多功能酶標儀震蕩5 s，測745 nm處的A值，計算ABTS的清除率。

式中：A1為樣品的A值;A2為空白對照;A0為ABTS工作液的A值。

1.4.4 鐵還原能力測定(FRAP)

取TPTZ溶液、TPTZ稀釋液、檢測緩沖液按1∶10∶1的比例混勻(現配現用)，放入37 ℃電熱恒溫培養箱孵育5 min。在96孔板中，加入100 μL已配制好的FRAP工作液，再分別加入20 μL不同濃度的樣品液，最后加甲醇至每個檢測孔為200 μL，室溫下孵育5 min。利用多功能酶標儀測593 nm處的A值，以A值對不同濃度的FeSO4標準溶液作標準曲線，根據標曲計算總抗氧化能力。

2 結果與分析

2.1 清除DPPH自由基結果

9種配比當歸-黃芪藥對對DPPH自由基均有一定清除作用，在實驗濃度范圍內，清除率隨濃度增大而增大。當歸-黃芪藥對抗氧化能力大小依次為⑨1∶0>⑦3∶2>⑧5∶3>②2∶3>⑤1∶1>⑥2∶1>④0∶1>①1∶2>③1∶5。見表1。由此我們得知DPPH自由基清除實驗中當歸-黃芪藥對，當歸∶黃芪配比為1∶0時自由基清除率最大，達到97.7%。當歸∶黃芪配比為1∶5時自由基清除率為60.72%。而當歸∶黃芪配比為1∶0時的清除率相較于1∶5時高出近37%。

表1 當歸-黃芪不同配比對DPPH自由基清除率%Table 1 DPPH free radical scavenging rate of Angelica and Astragalus membranaceus in different proportions (%)

2.2 清除ABTS自由基結果

清除ABTS自由基9種配比當歸-黃芪藥對對ABTS自由基均有一定清除作用，在實驗濃度范圍內，清除率隨濃度增大而增大。9種當歸-黃芪藥對抗氧化能力大小依次為②2∶3>⑨1∶0>⑦3∶2>⑤1∶1>⑥2∶1>⑧5∶3>①1∶2>④0∶1>③1∶5。見表2。我們通過實驗得到當歸∶黃芪配比為2∶3時自由基清除率高達101.93%。當歸∶黃芪配比比例為1∶0時的清除率為98.77%僅次于配比為2∶3的自由基清除率。而當歸∶黃芪配比為1∶5自由基清除率僅為70.12%。

表2 當歸-黃芪不同配比對ABTS自由基清除率%Table 2 ABTS free radical scavenging rate of Angelica and Astragalus membranaceus in different proportions (%)

2.3 鐵還原能力測定(FRAP)結果

實驗結果顯示在FRAP值中當歸-黃芪藥對各個部位抗氧化能力大小依次為⑨1∶0>⑥2∶1>⑦3∶2>⑧5∶3>②2∶3>⑤1∶1>①1∶2>④0∶1>③1∶5。結果見表3。通過結果得知當歸∶黃芪配比為1∶0時抗氧化能力最強，當歸∶黃芪配比為1∶5時抗氧化能力最弱。

表3 當歸-黃芪不同配比的FRAP值Table 3 FRAP values of different proportions of Angelica and Astragalus

3 結 論

自由基對機體的氧化損傷與人體的多種疾病有著緊密的關系。中藥是抗氧化成分的重要來源，許多研究發現中藥的藥理作用與抗氧化活性成分有關。中藥抗氧化成分多為酚類化合物、黃酮類、皂苷類、多糖類、有機酸類、萜烯等[6]，經過配伍后彼此間起到了良好的抗氧化協同效應。黃芪-當歸是近代中藥方劑中的常見藥對，二者均為益氣補血常用藥，經歷代醫家證實其臨床療效確切[7]。黃芪是我國中醫最常用的“扶正固本，補中益氣”中藥之一。現代藥理研究表明其具有提高免疫功能、抗應激、抗衰老、抗氧化等作用[8-9]。當歸是中醫補血活血最常用的中藥之一，研究表明有促進機體造血功能、降血脂、免疫調控同時具有抗血栓、抗腫瘤、抗氧化作用，兩藥合用協同抗氧化可以改善多種疾病[10-11]。

抗氧化活性可以用在特定條件下，樣品對檢測體系中自由基的清除能力、抗過氧化能力及樣品的還原能力、總抗氧化能力等來衡量和表征[12]。DPPH自由基是一種合成的、具有單電子、穩定的、以氮為中心的順磁化合物。如果物質能夠清除DPPH自由基，則說明受試物能降低氧自由基和碳自由基的有效濃度，從而達到阻斷自由基反應鏈的作用。ABTS[2，2-連-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]主要用于測定樣品血紅蛋白含量。FRAP該方法的原理是氧化還原反應，能反映待測樣品的還原能力[13]。

本次課題研究通過采用 DPPH法、ABTS法及FRAP法，對黃芪-當歸藥對體外抗氧化能力進行了檢測，通過測定9組不同配伍比例下6種濃度的抗氧化能力，反應黃芪-當歸藥對不同配伍的抗氧化能力的強弱，對其揭示傳統藥方的經典配伍比例的作用。通過實驗我們發現出自《內外傷辨惑論》中當歸補血湯經典配比當歸∶黃芪為1∶5時抗氧化能力相較于配比為 1∶0時的抗氧化能力差距較大，本課題實驗表明當歸-黃芪配比為1∶0時自由基清除率相較于配比為1∶5高出近37%。在采用DPPH法和ABTS法FRAP法三種方法對黃芪-當歸藥對體外抗氧化能力檢測時，發現當歸比例高于黃芪比例的的藥對中抗氧化性也越強，同時自由基的清除率隨濃度的增加而增加。通過實驗研究也顯示中藥的配伍所采用的藥對濃度可能會對人體療效產生較大的影響，而中藥對于治療人體疾病的藥性可能也會隨著所采用藥物濃度的大小而改變。此研究為后續對于黃芪-當歸配比用藥提供了實驗依據，為其臨床用藥治療上提供了方案。