高效液相色譜法測定藜麥中蘆丁含量

田旭靜，崔小芳

（1.山西鐵道職業技術學院，山西 太原 030013；2.山西錦爍生物醫藥科技有限公司，山西 晉中 030600）

藜麥是一種原產于南美洲安第斯中高海拔山區的藜科藜屬植物，具有相當全面的營養物質，因此被賦予“營養黃金”的稱號[1]。至今，藜麥已有幾千年的種植和食用歷史，藜麥不僅具有高蛋白，還富含對人體健康有利的多酚、皂苷、維生素等營養物質，被推薦為全谷全營養食品[2]。藜麥的營養品質受氣候、土壤、種植條件等因素的影響，目前在山西、四川、陜西等地廣泛種植。

蘆丁是維生素P屬的一類黃酮類化合物，可以通過清除氧自由基，進而對油脂過氧化作用產生明顯的抑制作用，可用作開發新型食用油脂[3]。蘆丁可以改善血管的功能，維持毛細血管的彈性，使血管的脆性和通透性降低，醫學上可降低高血壓、糖尿病、視網膜出血等一系列疾病的發生率。目前可以采用比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法、紫外分光光度法等來測定蘆丁的含量，其中效率最高、應用最廣的方法是高效液相色譜法[4]。

高效液相色譜法（HPLC）是一種重要的分離檢測技術，已作為食品、藥品檢驗的重要方法之一。HPLC是采用高壓輸液系統，將流動相注入系統，樣品通過進樣系統隨流動相進入分離系統，樣品中各組分由于極性不同，在分離系統中實現分離，依次進入檢測系統在相應條件下得到不同的響應值，依據響應值對樣品中各組分進行定量分析。流動相可以為多種溶液按照規定的比例制作為混合溶液，也可以使用單一溶液的方式。分離系統有色譜柱和控溫組成。HPLC技術和傳統的色譜檢驗方法相比，具有檢測自動化水平高，分析速度快、精度高的優勢，精度能夠達到0.01 ng，所以在食品檢驗領域價值高[5]。本試驗采用高效液相色譜法測定藜麥中的蘆丁含量，并對此方法的重復性、穩定性和精密度進行研究，旨在為進一步提取蘆丁原料和篩選蘆丁含量高的藜麥種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

ASl0200AT超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯；Vanquish Core（VWD）高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；MILLIPORE超純水器（美國密理博公司），電子分析天平（德國賽多利斯CP-224S）。

1.2 試劑

蘆丁標準品（壇墨質檢科技股份有限公司，純度98.%），甲醇為色譜純，超純水，山西忻州靜樂縣藜麥。

1.3 色譜條件

采用Agela Technologies Venusil ABS C18柱，流動相為乙腈-水（2∶8），采用梯度洗脫，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長200 nm，進樣量20μL。

1.4 蘆丁標準溶液的配制

用天平準確稱定蘆丁標準品10 mg于量瓶中，加入甲醇溶液進行溶解，然后稀釋定容至25 mL，搖勻，得到質量濃度為400μg·mL-1的蘆丁標準品儲備液。取適量儲備液稀釋成2μg·mL-1、4μg·mL-1、8μg·mL-1、35μg·mL-1、60μg·mL-1、120μg·mL-1質量濃度梯度，按前述色譜條件取20μL進樣[6]。蘆丁標準品的色譜圖見圖1。

圖1 蘆丁標準品色譜Fig.1 The standard chromatogram of rutin

1.5 樣品處理

取藜麥樣品80 g，先進行脫殼處理，然后置于40℃烘干箱中鼓風干燥3 h后研細，過0.25 mm篩，用天平精密稱定5.0 g，加入50 mL甲醇溶液溶解于150 mL磨口錐形瓶中，密塞搖勻，超聲提取30 min，再回流水解1.5 h，用甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，過濾，取一定量的提取液經0.45μm濾膜（Milipore，USA）過濾后，取20μL直接進樣[7]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線和線性范圍

將蘆丁標準溶液系列從低濃度到高濃度進行排序，根據試驗方法分別進樣20μL進行測定。標準曲線是以質量濃度x值為橫坐標，以峰面積Y值為縱坐標繪制而成，見圖2。結果可見，在2～120μg·mL-1蘆丁標準品的質量濃度和相應的峰面積之間線性關系保持良好。線性回歸方程為y=0.316 44x-0.068 1，相關系數r=0.999 9[7]。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 The standard curve of rutin

2.2 加樣回收率試驗

用天平準確稱定藜麥樣品5 g（其中蘆丁含量為2.83μg/g）共6份，分別置于量瓶中，將蘆丁濃度為2μg·mL-1的標準品溶液以1 mL，15 mL的標準各加入3份于6份樣品中。按照樣品測定方法進行峰面積的測定和蘆丁含量的計算[8]。由表1可以看出，蘆丁的平均回收率為98.33%，相對標準偏差RSD為2.02%。

表1 回收率試驗結果Tab.1 The recovery test results

2.3 樣品的測定

按照上文1.5所述對樣品進行處理，用天平精密稱取6份樣品，超聲提取后將提取液進行過濾，分別取20μL直接進樣。樣品1～6的蘆丁含量分別為2.76μg/g，2.81μg/g，2.74μg/g，2.84μg/g，2.88μg/g，2.71μg/g[8]。

2.4 精密度試驗

取同一濃度蘆丁標準品溶液，重復精密吸取5次各20μL，在1.3色譜條件下進樣，將5次的峰面積值做好記錄，結果表明5次峰面積值的RSD為1.22%，說明儀器具有良好的精密度[6]。

2.5 重復性試驗

用天平準確稱定藜麥樣品5.0 g共5份，對樣品處理后，進行提取制備，從5份樣品提取液中各取20μL進樣，進行5次峰面積值的測定和蘆丁含量的計算，RSD為0.69%，說明本法重復性比較好[7]。

2.6 穩定性試驗

選擇藜麥樣品溶液進行穩定性試驗，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進樣20μL測定，不同時間內的峰面積值見表2。結果表明藜麥樣品中蘆丁峰面積值的RSD為0.91%，表明該樣品在12 h內具有較好的穩定性[6]。

表2 藜麥中蘆丁穩定性試驗結果Tab.2 The stability test results of rutin in Quinoa

3 結語

本試驗結果表明，在2～120μg·mL-1范圍內，蘆丁標準品的質量濃度和相應的峰面積之間線性關系保持良好。線性回歸方程為y=0.316 44x-0.068 1，r=0.999 9，平均加樣回收率為98.33%，RSD為2.02%。其中重復性，穩定性，精密度均能符合試驗要求，因此本試驗方法測定蘆丁方法可靠簡便，適合于藜麥產品的質量標準檢測。

在很多蘆丁測定的研究中，樣品中的蘆丁一般采用乙醇或甲醇來進行提取[8]。本試驗分別用乙醇和甲醇對藜麥中蘆丁進行提取試驗，結果發現，采用甲醇作為藜麥中蘆丁的提取劑效果更好，樣品的回收率、穩定性、重復性更符合試驗要求[9]。同時測定藜麥種質的蘆丁含量，篩選出蘆丁含量比較高的藜麥種質，可為后續藜麥功能育種研究提供相關依據。