柑橘黃龍病菌RAA檢測技術研究與應用

陳海云，邱英華，滕麗瓊，鄭蘇華

（南寧眾冊生物科技有限公司，廣西壯族自治區 南寧 530007）

柑橘黃龍病（Cirtus huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產中的一種破壞性病害，主要分布在近50個國家和地區，包括亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北部地區[1]。目前，初步認定柑橘黃龍病病原菌由限制于韌皮部的難養細菌（Candidatus Liberobacter）引起，該病原菌屬于革蘭氏陰性細菌，暫時還不能人工培養。根據傳播媒介和病原的熱敏性及病原菌16S r DNA和β-操縱子基因的序列特征，將柑橘黃龍病菌分為非洲種、亞洲種和美洲種[2]。病原菌嚴重影響寄主韌皮部，可引起葉片黃化、果實商品價值降低、枝條枯梢和樹體死亡[3]。黃龍病的自然傳播方式主要為柑橘木虱傳播、人為傳播和菟絲子傳播等方式，傳播途徑復雜且范圍廣，防控難度大[4]。近幾年來，廣西區柑橘類水 果面積快速擴大，根據廣西區統計局統計，廣西柑橘種植面積60×104hm2，產量1 000×104t，是廣西農村經濟的支柱產業之一，在農民脫貧致富奔小康和新農村建設中發揮著重要作用。種植面積的急速擴大使得柑橘感染黃龍病的染病危險系數大增，廣西區內柑橘黃龍病發生面積達867 hm2，一旦出現重大病情，將會對廣西果業與經濟造成沉重打擊。

柑橘黃龍病是柑橘生產中的重大病害，其病原菌能夠侵染柑橘及其近緣屬植物，目前尚無有效的防治方法，仍以防控為主。通常只能采取連根挖除并燒毀染病植株的辦法，防止黃龍病菌擴散，中斷傳染源。如能在早期發現、甄別黃龍病病菌，及時切斷傳染源控制黃龍病蔓延，對保障柑橘產業的健康發展具有重要現實意義，因此，研究開發一種能快速、準確、安全的診斷柑橘黃龍病的檢測技術成為柑橘黃龍病防控及柑橘產業健康發展的迫切需求。

建立一種快速、準確、高效的檢測方法，對柑橘黃龍病的檢測具有重要意義。而重組酶介導的等溫核酸擴增（Recombinase-acidAmplification，RAA）技術是一種利用重組酶、單鏈結合蛋白、DNA聚合酶,替代了PCR高溫變形循環過程，在37℃恒溫條件下快速、靈敏檢測目的基因片段[5]。具體原理為：從細菌或真菌中獲得的重組酶，在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA、單鏈結合蛋白緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白（single-stranded DNA binding，SSB）的幫助下，使模板雙鏈DNA解旋，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈。單鏈結合蛋白（SSB）防止單鏈DNA復性，在能量和dNTP存在的情況下，由DNA聚合酶完成鏈的延伸，5～20 min便可完成擴增。此外，RAA技術還能夠完成多重引物擴增，利用不同顏色的熒光標記，在同一個反應里檢測到不同的目的基因[6]。

RAA技術具有以下技術優勢：①操作簡單，無需專業人員也可完成樣本的分子層面檢測；②設備便攜，能應對各種惡劣環境，實現移動執法，抗干擾強；③5～15 min出檢測結果，實現真正意義上的“快檢”；④37℃～39℃的常溫恒溫反應，無需另購熱循環儀或其他昂貴設備；⑤靈敏度高，特異性強，精準識別目標基因片段，所得結果準確無誤；⑥采取先進的凍干技術，將其制成干粉試劑，可直接上機檢測，便于運輸，操作更簡便，避免反復凍融帶來的誤差和損耗。

本研究擬基于RAA技術建立柑橘黃龍病的檢測方法。利用RAA技術建立黃龍病菌的檢測體系，測試檢測方法的特異性和靈敏性，評價RAA在黃龍病原檢測方面的適用性。結合熒光探針建立熒光RAA反應體系，開展敏感性及特異性評價，評價熒光RAA在黃龍病原檢測方面的適用性。建立側流層析試紙條的AA-LFD方法，評價這種方法的靈敏度、特異性。固定試劑組分，組裝成試劑盒，進行試劑盒靈敏度、特異性、保存方式、保質期、穩定性等方面的測試。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

植物樣品主要來自南寧各個縣區的柑橘種植園，植株葉片出現原因不明的黃化現象。陰性對照為水果站提供的健康植株。

1.2 主要生物學試劑

DNA提取試劑盒為天根生物公司高效植物基因組DNA提取試劑盒，DNA Marker DL 2000購自寶生物工程（大連）有限公司，RAA恒溫核酸快速擴增試劑（熒光型），即RAA擴增試劑，南寧眾冊生物科技有限公司自主研發生產凍干。2×Taqman PCR Mix購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器

Genchek RAA檢測儀購自杭州眾測生物科技有限公司。TGL-16MS高速冷凍離心機為上海盧湘儀離心機儀器有限公司產品。Nanophotometer NP80 Touch微量紫外分光光度計為德國implen公司產品。

1.4 樣品核酸提取

柑橘植株總基因組的提取方法參照杭州眾測生物科技有限公司RAA基礎型核酸擴增試劑盒。將少量酒精倒入研缽，研磨棒，藥匙，后點燃進行滅菌消毒，待研缽冷卻后，取少量新鮮柑橘葉脈，用剪刀剪碎后放入研缽中，一邊加入液氮一邊研磨，后續提取程序參照基因組提取試劑盒說明書。取1μL提取的基因組DNA在超微量分光光度計上檢測樣品濃度及純度，260/280比值介于1.8～2.0。剩余樣品置于-20℃冰箱貯藏備用。

1.5 RAA引物、探針的設計與合成

依據RAA引物設計原則，以NCBI數據庫中50S核糖體亞基 基 因 序 列（MN117984.1、MN117983.1、MG384706.1、KY990824.1、KY550699.1、MN563116.1、MN563108.1、CP010-804.2、MK542517.1、MG256971.1）保守區域為靶位點，采用DNAMAN6.0軟件進行序列比對分析，選取同源性高的片段，用Primer primer5.0設計了探針及4對引物（表1）。以標準質粒pUC57-50S（1×102copies/μL）作為模板，根據RAA熒光型反應對探針的要求對探針進行標記，以RAA熒光型核酸擴增試劑盒對引物進行篩選。擴增反應參照試劑盒說明書進行，反應條件為37℃、20 min。選擇擴增效率最佳的1對引物。以上引物及探針均由北京六合華大基因科技有限公司合成，具體信息詳見表1。熒光定量PCR引物探針序列見表2。

表1 RAA引物探針序列Tab.1 The sequence of RAA primer probe

表2 熒光定量PCR引物探針序列Tab.2 The primer probe sequence of fluorescent quantitative PCR

1.6 反應體系和反應程序

以上述提取的DNA為模板進行RAA檢測。反應體系（50μL）：水27.4μL，20%PEG 12.5μL，上下游引物各2.0μL（引物濃度10μmol/L），探針0.6μL（探針濃度10μmol/L），DNA模版5.0μL，280 mmol/L乙酸鎂2.5μL；反應程序：預熱階段39℃40 s，1個循環；循環階段39℃，30 s（收集熒光信號），40個循環；熒光通道：FAM。

PCR反應體系（25μL）：水5μL，2×Taqman PCR mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，探針0.5μL，模板5μL；反應程序95℃10 min，循環階段為95℃15 s，60℃20 s，共45個循環。

1.7 RAA熒光反應條件優化

比較RAA反應體系中PEG的終濃度為4%、4.5%、5%、5.5%、6%時的擴增效率；比較醋酸鎂濃度在260 mmol/L、270 mmol/L、280 mmol/L、290 mmol/L、300 mmol/L時的擴增效率，對反應條件進行優化。

1.8 RAA方法的特異性測試

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌、單核細胞增生李斯特菌、支氣管敗血波氏桿菌、Ⅱ型豬鏈球菌的參考菌株提取的DNA為模板，分別使用上述1.6反應體系和反應程序進行RAA檢測，驗證所建立方法的特異性。

1.9 RAA方法的靈敏度測試

50S核糖體亞基基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成克隆質粒。將質粒以10倍梯度進行稀釋，濃度分別為1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL copies/μL、1×100copies/μL、1×10-1copies/μL。將稀釋后的質粒分別作為質粒靈敏度試驗的陽性標準品，對經梯度稀釋的陽性標準品分別使用上述1.6反應體系和反應程序進行RAA檢測，驗證所建立方法的靈敏度。

1.10 樣品檢測

取1.4的提取的樣本DNA作為模板，分別使用上述的反應體系和反應程序進行RAA檢測和PCR檢測，以掌握所建立方法對盲樣的檢測情況。在提取樣品或菌株DNA的過程中，分別同時提取DEPC水作為陰性對照，用以驗證提取過程是否出現DNA污染。

2 結果與分析

2.1 RAA引物篩選結果

樣品采集按照相關標準采集，標本短期內可保存于-20℃。使用DNA快速提取試劑盒提取柑橘葉的DNA基因組，首先取柑橘葉片的主葉脈3～5條，用剪刀剪碎至1.5 mL離心管中。剪碎的樣品加入300μL的Ll裂解液，用研磨棒將葉脈盡量研碎，再加入300μL的L2裂解液，混勻，短管離心30 s，取5μL上清作為模板，直接進行RAA擴增。樣本檢測操作步驟：向干粉反應管中加入42.5μL的ABuffer；向干粉反應管中加入5.0μL經2.4處理得到的待測樣本DNA，并同時設立陰陽性對照；再向干粉反應管蓋中加入2.5μL的BBuffer，蓋上管蓋，上下翻轉混勻5～6次，低速離心10 s；將干粉反應管放入Genchek系列熒光檢測儀（或其他熒光定量PCR儀）中，選擇RAA檢測程序，開始檢測。

以質粒pUC57-50S（1×10 copies/μL）作為模板，上下游各4條引物共16種組合進行RAA熒光反應，得出最佳引物組合F2/R3。以質粒pUC57-50S（1×102copies/μL）作為模板，上下游各4條引物共16種組合進行RAA熒光反應，結果顯示，引物對F2/R3相對于其他引物對的出峰時間更早，熒光值更高（圖1），因此選用引物對F2/R3為最佳引物。

圖1 引物篩選結果Fig.1 The primer screening results

2.2 RAA熒光反應條件優化結果

經過反應條件優化，結果顯示PEG終濃度在5%（圖2A）、醋酸鎂終濃度在280 nmol/L（圖2B）時擴增效率最佳，與試劑盒中的反應體系相符。

圖2 不同PEG和醋酸鎂濃度下RAA熒光反應Fig.2 The RAA fluorescence reaction under different PEGand magnesium acetate concentrations

2.3 特異性試驗結果

利用本試驗建立的方法在ABI 7500實時熒光PCR儀及Genchek RAA檢測儀上對不同病原菌進行特異性測試。結果顯示，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌、單核細胞增生李斯特菌、支氣管敗血波氏桿菌、Ⅱ型豬鏈球菌及陰性對照均未出現擴增曲線，僅陽性對照出現擴增曲線。表明所建立的RAA熒光檢測方法具有較強的特異性。

圖3 特異性試驗結果Fig.3 The specific test results

2.4 靈敏度試驗結果

利用本試驗建立的方法在ABI 7500實時熒光PCR儀及Genchek RAA檢測儀上進行靈敏度測試，以熒光PCR作為對比。標準質粒濃度分別為1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL、1×100copies/μL、1×10-1copies/μL。結果顯示熒光PCR法和RAA熒光法最低可檢測到10拷貝/μL的質粒標準品。

圖4 PCR 7500 Genchek的靈敏度圖Fig.4 The sensitivity map of PCR 7500 Genchek

2.5 樣品檢測情況

采集的102份可疑柑橘葉樣本提取核酸后在ABI 7500實時熒光熒光PCR儀及Genchek RAA檢測儀上進行RAA熒光法的檢測。與熒光PCR法進行對比RAA檢出率要偏高一些，實時熒光定量陽性57份，陰性45份，陽性率44.12%。RAA實時熒光60份樣本核酸為陽性，42份樣本核酸為陰性，所建立的RAA熒光法在ABI 7500實時熒光PCR儀及Genchek RAA檢測儀上的檢測與熒光PCR檢出符合率均為97%，表明所建立的RAA熒光法配合便攜式Genchek RAA檢測儀可用于現場檢測。

3 討論

目前，國內外已報道的相關柑橘黃龍病檢測方法有田間診斷與指示植物檢測、碘-淀粉沉淀法，顯微鏡觀察法，血清學鑒定法等。分子生物學主方法主要有免疫學檢測、PCR法、DNA雜交法、環介導等溫擴增（LAMP）法，但是這些技術需要專業人士操作，且步驟較繁瑣，等待時間也比較長，不太適合柑橘園中進行大規模的快速檢測[7]。針對我國柑橘黃龍病目前暫無特效藥劑防治仍需要以預防為主的現狀，將現代分子生物學核酸檢測技術應用于柑橘黃龍病的早期病菌篩查檢測中，利用英、美歸國科學家團隊領銜開發的世界領先的重組酶介導鏈替換核酸擴增技術（簡稱RAA技術），建立黃龍病菌的檢測體系，研發具有操作簡單、設備便攜、檢測快速、常溫反應、結果準確等特性的柑橘黃龍病RAA檢測試劑盒，實現黃龍病早期病菌的快速準確檢測，以盡早發現和甄別感染病菌植株，切斷黃龍病傳染源，對柑橘黃龍病的防控及柑橘產業的發展具有重要意義，同時彌補了廣西柑橘黃龍病RAA檢測技術的空白，有效帶動南寧市植物病害核酸檢測技術的發展及綜合競爭力的提升。同時，通過項目的實施，進一步提高公司整體研發人員尤其是青年研發人員的技術水平，形成良好的研發機制及帶頭示范作用，進一步提升公司體外診斷試劑的整體研發水平及綜合創新能力。

目前，RAA技術還處于初期階段，正在不斷優化反應溫度、時間和結果判讀方式[8]，但是對于一個剛出現的新技術而言，能夠在體外37℃左右的溫度下迅速擴增出目的片段，且反應時間僅需10～20 min，已經是很好的成績，并已有科研單位研發出家用柑橘黃龍病分子診斷試劑盒。此外，RAA技術也是目前唯一可能研究出體內核酸擴增技術的后備技術。反應結果可通過瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光曲線監控、試紙條（側流層析試紙條LFD）多種方式進行快速判讀[9-11]。與其他DNA擴增技術相比，它不需要貴重的設備，能夠在更短時間內和較低溫度下擴增目的DNA。傳統PCR和熒光PCR需要昂貴且體積較大的設備，反應時間也因核酸類別和片段大小而異，通常擴增時間都較長，常為50～150 min[10-13]。綜合以上表明，RAA技術優勢顯著，具有便攜、高效、高靈敏度、實用性廣的特點，且對試驗人員操作技術要求低，實驗所需環境和設備要求不高，尤其適合于大規模的流行病學篩查和現場的快速檢測。

本研究所建立的RAA檢測方法能夠準確鑒別出柑橘黃龍病。通過對方法的特異性、靈敏度、穩定性、盲樣檢測等一系列驗證，證明所建立的檢測方法對柑橘黃龍病病原菌具有顯著特異性。本研究基于RAA所建立的黃龍病檢測方法能夠滿足大規模果園的篩查和快速檢測，相信隨著反應體系和反應條件的不斷優化，RAA法能夠利用它的優勢，在檢測黃龍病方面廣泛發揮作用。