LncRNA MEG3與miR-31在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用及意義

張 剛，李哲麗，劉玉鳳，鄭少華，趙 芝，牛國超

據(jù)統(tǒng)計，結(jié)腸癌發(fā)病率居胃腸道惡性腫瘤的第3位，發(fā)病機制與遺傳、環(huán)境等多種因素導致結(jié)腸黏膜上皮基因改變密切相關(guān)[1]。明確相關(guān)基因作用機制對早期防治結(jié)腸癌具有重要意義[2-3]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預后情況聯(lián)系緊密。有研究表明，LncRNA母系印記基因3(LncRNA MEG3)在正常組織中表達，但在多種腫瘤細胞中呈現(xiàn)表達缺失現(xiàn)象，具有抑癌作用[4]。微小RNA(miRNA)屬于內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，其中miR-31異常表達會影響腫瘤相關(guān)基因活性，參與腫瘤細胞增殖、侵襲過程[5]。但關(guān)于二者在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用仍不明確。故本研究嘗試探討LncRNA MEG3與miR-31在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用及意義，旨在為防治結(jié)腸癌及癌前病變提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2016年6月—2018年8月手術(shù)切除的62例結(jié)腸腺瘤組織、62例結(jié)腸腺瘤癌前病變組織、62例結(jié)腸癌組織。納入標準：經(jīng)內(nèi)鏡形態(tài)學及病理檢查證實腫瘤性質(zhì)；未合并其他部位惡性腫瘤；所有組織標本經(jīng)手術(shù)切除后冷凍保存；臨床資料完整。排除標準：腫瘤性質(zhì)難以明確者；合并其他惡性腫瘤者；存在其他結(jié)直腸疾病者。62例結(jié)腸腺瘤患者中男35例，女27例；年齡34～68(48.67±4.06)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為17～30(21.95±1.46)kg/m2。62例結(jié)腸腺瘤癌前病變患者中男33例，女29例；年齡32～69(48.13±5.05)歲；BMI為18～30(22.18±1.22)kg/m2。62例結(jié)腸癌患者中男36例，女26例；年齡33～70(49.03±5.34)歲；BMI為18～31(22.30±1.43)kg/m2。3組性別、年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 取100 mg凍存的結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺瘤癌前病變、結(jié)腸癌組織放置于研磨器中，加入Trizol 1 ml后置于液氮中將組織標本磨成粉末狀，提取RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在-80 ℃恒溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。LncRNA MEG3、miR-31、GAPDH引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。遵循美國BIOMIGA公司SYBR Green Ⅰ說明書配置反應體系，取cDNA采用LightCycler96熒光定量PCR儀進行qRT-PCR，反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進行40個循環(huán)，每個樣品設置3個復孔，反應結(jié)束后得到各反應管循環(huán)閾值，以GAPDH作為LncRNA MEG3內(nèi)參，U6作為miR-31內(nèi)參，以2-ΔΔCq法計算LncRNA MEG3、miR-31相對表達量。

1.3觀察指標 ①不同序列轉(zhuǎn)化階段LncRNA MEG3、miR-31相對表達量；②LncRNA MEG3與miR-31表達在不同序列轉(zhuǎn)化階段的相關(guān)性；③LncRNA MEG3與miR-31表達在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用；④LncRNA MEG3、miR-31表達與結(jié)腸癌患者病理特征的相關(guān)性；⑤LncRNA MEG3、miR-31表達對結(jié)腸癌患者生存率與死亡危險度的影響。

2 結(jié)果

2.1不同序列轉(zhuǎn)化階段LncRNA MEG3、miR-31相對表達量 LncRNA MEG3相對表達量在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸下降趨勢，miR-31相對表達量在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸升高趨勢(P<0.01)，見表1。

表1 不同結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化階段LncRNA MEG3、miR-31相對表達量

2.2LncRNA MEG3與miR-31表達在不同序列轉(zhuǎn)化階段的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，LncRNA MEG3與miR-31在結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺瘤癌前病變、結(jié)腸癌組織中均呈負相關(guān)(r=-0.741、-0.753、-0.774，P<0.05)，見圖1。

2.3LncRNA MEG3與miR-31表達在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用 LncRNA MEG3與miR-31表達在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用分析顯示,LncRNA MEG3單獨低表達所致結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化的OR值為13.050，miR-31單獨高表達所致的結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化的OR值為4.641，二者同時存在時，交互作用OR值為30.375，γ為2.244，提示LncRNA MEG3低表達與miR-31高表達在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈正向交互作用(為次相乘模型)。見表2。

表2 LncRNA MEG3與miR-31表達在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用

2.4LncRNA MEG3、miR-31表達與結(jié)腸癌患者病理特征的相關(guān)性 LncRNA MEG3、miR-31相對表達量與結(jié)腸癌患者年齡、性別、腫瘤直徑無明顯相關(guān)性(P>0.05)；LncRNA MEG3相對表達量與結(jié)腸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，與結(jié)腸癌組織分化程度呈正相關(guān)，miR-31相對表達量與結(jié)腸癌組織臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與結(jié)腸癌組織分化程度呈負相關(guān)(P<0.01)。見表3。

表3 LncRNA MEG3、miR-31表達與結(jié)腸癌患者病理特征的相關(guān)性

2.5LncRNA MEG3、miR-31表達對結(jié)腸癌患者生存率與死亡危險度的影響 KM生存曲線分析，LncRNA MEG3低表達結(jié)腸癌患者3年生存率低于高表達患者，miR-31高表達的結(jié)腸癌患者3年生存率低于低表達患者(P<0.05)，見圖2。經(jīng)RR檢驗，LncRNA MEG3低表達結(jié)腸癌患者3年內(nèi)死亡危險度是高表達患者的7.000倍(95%CI：1.027，47.704)；miR-31高表達結(jié)腸癌患者3年內(nèi)死亡危險度是低表達患者的4.810倍(95%CI：1.846，12.536)。見表4。

表4 LncRNA MEG3、miR-31表達對結(jié)腸癌死亡危險度的影響

3 討論

結(jié)腸腺瘤是臨床常見胃腸道良性腫瘤，發(fā)病與居民飲食習慣、生活方式等因素密切相關(guān)，若未得到及時有效干預，隨著病情進展可引發(fā)癌前病變，最終發(fā)展為結(jié)腸癌[6-8]。因此，積極探索結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中基因改變的作用機制對降低癌前病變、結(jié)腸癌發(fā)生風險，延長結(jié)腸癌患者生存期具有重要意義。LncRNA是一類長度>200 nt的非編碼RNA，具有廣泛的生物學功能，可通過調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄在多種疾病中發(fā)揮作用。LncRNA MEG3屬于小鼠母體印記基因Glt2的人類同系物，定位于染色體14q32，是第一個有腫瘤抑制功能的LncRNA[9-10]。既往多項研究表明，LncRNA MEG3在肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮調(diào)控腫瘤細胞作用，且在上述惡性腫瘤細胞中表達缺失[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3相對表達量在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸下降趨勢，可見LncRNA MEG3低表達能促進結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過程。分析原因，主要是由于LncRNA MEG3可作為抑癌因子發(fā)揮作用，能夠啟動腫瘤細胞凋亡機制，激活內(nèi)源性凋亡途徑，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激因子、Bcl-2活性，上調(diào)Bax表達，從而誘導腫瘤細胞凋亡，因此在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過程中LncRNA MEG3為滿足抑制腫瘤細胞、增殖需求而被過度損耗，呈現(xiàn)低表達甚至表達缺失現(xiàn)象[13]。胥光熱等[14]報道證實，在結(jié)腸癌細胞中敲減LncRNA MEG3后腫瘤細胞增殖顯著加快。本研究數(shù)據(jù)表明，LncRNA MEG3相對表達量與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)論相符，說明LncRNA MEG3低表達會加快結(jié)腸癌進展，可作為臨床預測結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化的重要指標。

miRNA屬小分子單鏈非編碼RNA，廣泛表達于真核生物內(nèi)，成熟的miRNA具有調(diào)控基因表達作用。miR-31是與腫瘤相關(guān)的熱點基因，定位于9p21.3，具有調(diào)節(jié)胚胎著床、發(fā)育功能，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-17]。張翌等[18]研究顯示，miR-31過表達能促進結(jié)腸腺瘤惡性轉(zhuǎn)化，加快結(jié)腸癌發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，miR-31相對表達量在序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸升高趨勢，且與結(jié)腸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與腫瘤分化程度呈負相關(guān)，提示miR-31過表達不僅會促進結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化，還與結(jié)腸癌患者病理進展顯著相關(guān)。推測主要原因：①miR-31過表達能下調(diào)上皮標志物表達，上調(diào)間質(zhì)標志物表達，從而增強腫瘤增殖能力，促進結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展[19]；②miR-31能異常激活Wnt/β-catenin信號通路，導致該信號通路靶基因異常表達，提高腫瘤細胞侵襲、遷移能力，進而促進結(jié)腸癌的發(fā)生及進展[20]；③miR-31基因啟動子區(qū)的甲基化會導致miR-31異常表達，影響下游轉(zhuǎn)錄因子活性，加快腫瘤細胞分化、浸潤[21]。故miR-31有望成為結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化的標志物，能為臨床制定科學防治措施提供有效信息。

本研究嘗試探討LncRNA MEG3與miR-31在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)系及交互作用，結(jié)果顯示二者在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過程中呈負相關(guān)，且LncRNA MEG3低表達與miR-31高表達在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈正向交互作用(為次相乘模型)，提示LncRNA MEG3低表達與miR-31高表達對結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化具有促進作用。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3低表達結(jié)腸癌患者3年生存率低于高表達患者，死亡危險度是高表達患者的7.000倍，miR-31高表達結(jié)腸癌患者3年生存率低于低表達患者，死亡危險度是低表達患者的4.810倍，佐證了LncRNA MEG3低表達與miR-31高表達會對結(jié)腸癌患者生存狀況產(chǎn)生明顯影響。但本研究屬于單中心、小樣本分析，可能造成數(shù)據(jù)偏倚，需收集更多病例做進一步分析，以獲取更為可靠的數(shù)據(jù)支持。

綜上，LncRNA MEG3低表達與miR-31高表達在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中具有正向交互作用，且二者均與結(jié)腸癌患者病理特征、生存狀況密切相關(guān)，能為臨床制定治療方案、預測預后提供有效信息。