UPLC-MS/MS法測定豬肉及其制品中己烯雌酚殘留量

孫亞南，李媛

陜西省產品質量監督檢驗研究院（西安 710048）

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是人工合成的非甾體雌性激素類藥物，因其能夠提高動物日增重和減少脂肪、促進蛋白質代謝合成、提高飼料轉化率、在動物的促生長和育肥方面具有較好效果，常被作為生長促進劑用于畜牧養殖業中[1-5]。然而，隨著己烯雌酚在動物體內的殘留累積，此類動物源性食品被人食用后會對肝、腎等內臟造成損害，破壞機體遺傳物質，導致基因突變[6]，對人體健康和生態環境均會造成嚴重危害[7-8]。2019年12月27日，我國農業農村部發布的第250號公告明確規定將己烯雌酚納入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單中[9]。己烯雌酚的檢測和監控對于保障相關畜禽類食品質量安全和人民生命健康具有重要意義。

已報道的有關動物源性食品中己烯雌酚的分析檢測方法主要有LC法、LC-MS法、HPLC法、HPLC-MS和免疫分析法等檢測方法[5,10-14]。其中，HPLC在提高分析靈敏度、重現性及其廣適性方面具有明顯優勢，故而成為科研工作者的首選。

試驗以叔丁基甲醚為提取劑，采用同位素內標法定量，建立豬肉中己烯雌酚的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，為豬肉及其制品中己烯雌酚的快速測定提供有效方案。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

豬肉樣品（市購）；豬肉粉質控樣（編號PKL04011305970B，廣州譜恩科學儀器有限公司）；己烯雌酚標準物質[編號GBW（E）083491，北京北方偉業計量技術研究院]；己烯雌酚-8氘代標準物質（貨號CCAD300663，美國CATO公司）；甲醇、乙腈、正己烷、叔丁基甲醚（均為色譜純）；超純水（優普系列超純水機制備）；Waters OasisTMHLB固相萃取柱（SPE柱，500 mg，6 mL，美國Waters公司）。

1.2 儀器與設備

1260-6420高效液相色譜-質譜串聯儀（美國Agilent Technologies公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合器（Scientific Industries公司）；FV64全自動智能氮吹儀（得泰儀器科技有限公司）；氮氣發生器（Peak Scientific Instruments公司）；EXTRA全自動SPE（上海屹堯儀器科技發展有限公司）；BSA224S分析天平[賽多利斯科學（北京）公司]；H1750R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

準確稱取2 g（精確到0.01 g）勻漿后的豬肉樣品于50 mL聚丙烯帶蓋離心管中，加入100 μL的己烯雌酚-D8標準物質（1 μg/mL），加6 mL叔丁基甲醚提取液，渦旋1 min，振蕩10 min，于-4 ℃，6 000 r/min離心5 min，上清液全部轉移至另一個50 mL聚丙烯帶蓋離心管中，向殘渣中加入6 mL叔丁基甲醚，按上述過程重復提取1次，合并2次提取液并充分混勻后，于40 ℃全部氮吹至干，加入2 mL 80%乙腈溶液，渦旋30 s使殘留物復溶，加入5 mL正己烷，渦旋混勻后于3 000 r/min離心5 min，取下層溶液待凈化。空白試驗除不加試樣外其余同上。

質控樣提取過程：稱取0.5 g（精確到0.01 g）豬肉粉質控樣，用1.5 mL水溶解復原，渦旋混勻，其余過程同上。

1.3.2 樣品凈化

SPE柱臨用前分別用3 mL叔丁基甲醚、3 mL甲醇和3 mL水預處理，保持柱體濕潤。將上述處理得到的下層待凈化提取液全部轉移至預處理過后的HLB固相萃取柱，以每3～4 s/滴的流速通過SPE柱，依次用甲醇-水（3∶7，V/V）、水、甲醇-2%氨水（1∶9，V/V）溶液各3 mL淋洗，棄去洗液，抽干。用7 mL甲醇-叔丁基甲基醚（1∶9，V/V）溶液洗脫，收集所有洗脫液，于40 ℃氮吹至干，準確加入2 mL 80%乙腈溶液溶解殘余物，充分渦旋，過0.22 μm有機濾膜，濾液供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 標準溶液的配制

用乙腈分別將己烯雌酚標準物質及其同位素內標己烯雌酚-D8配制成10 μg/mL的儲備液（-18 ℃保存），然后將儲備液用乙腈精確稀釋成1 μg/mL的中間液；分別準確移取適量的儲備液和中間液至10 mL容量瓶中，加入50 μL/mL同位素內標（中間液1 μg/mL），用乙腈定容至刻度，配制的己烯雌酚質量濃度依次為5，10，20，50，100，200，500和1 000 ng/mL，其中己烯雌酚-D8質量濃度為50 ng/mL。

1.5 液相色譜-串聯質譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18型（2.1 mm× 100 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；流動相A為乙腈，流動相B為水；梯度洗脫程序：0～1.0 min、10% A，1.5～5.0 min、90% A，5.5～6.0 min、10% A；流速0.3 mL/min；進樣體積10 μL。

1.5.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）負離子模式；多反應監測（MRM）掃描方式；毛細管電壓4.0 kV（ESI-）；碎裂電壓140 V；干燥氣溫度320 ℃；干燥氣流速13.0 L/min；霧化氣壓力206.9 kPa（30.0 psi）。

2 結果與討論

2.1 試驗條件優化

圖1為DES及其內標的標準溶液總離子流圖譜（標準物質質量濃度100 ng/mL、內標質量濃度20 ng/mL）。可以看出DES在該試驗條件下具有較好的分離度且響應值滿足信噪比要求，液相條件和質譜條件均能滿足后續試驗要求。

圖1 標準物質及內標總離子流圖譜

2.1.1 前處理方法選擇

分別考察采用2種不同前處理方法對質控樣品和空白樣品中添加水平為50 μg/kg（加標1）及100 μg/kg（加標2）的回收率情況，結果如圖2所示。方法1[15]是將樣品在乙酸鈉緩沖溶液中酶解后經乙腈提取，無水硫酸鈉除水，經QuEChERS吸附劑1凈化，濃縮復溶，因酶解過程耗時且提取凈化操作步驟繁瑣，增加己烯雌酚的損失，致使其回收率相對較低。方法2為試驗中的處理方法，均質樣品經叔丁基甲醚振蕩提取，冷凍離心，經正己烷除脂，SPE小柱凈化，大幅降低基質效應，該方法簡單高效，提取效果良好，目標物損失相對較少。試驗方法回收率明顯高于方法1。

圖2 2種不同前處理方法的回收率對比

2.1.2 提取劑選擇

相關文獻報道的關于動物源性食品中己烯雌酚的測定前處理方法主要采用乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等作為提取溶劑[16-18]。試驗考察乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚對DES的提取效率。圖3為豬肉空白樣品、加標樣品和豬肉粉質控樣的MRM圖譜。結果表明：以乙腈作為提取劑的質控樣品和加標樣品未檢測到目標物的特征峰；乙酸乙酯在提取DES的同時也萃取脂溶性雜質，使得樣品基質較為復雜，導致后續凈化困難，回收率低；相較之下，叔丁基甲醚提取率良好，在三者中的回收率最高，質控樣品和空白加標試驗的回收率均超過85%。故試驗選擇叔丁基甲醚作為提取試劑。

圖3 空白豬肉樣品（A）、加標豬肉樣品（B）（加標量50.0 μg/kg）和豬肉粉質控樣（C）的MRM圖

2.2 繪制標準曲線

試驗結果表明己烯雌酚在5～1 000 μg/kg的質量分數范圍內與其質譜響應值呈現良好線性關系，其中：在5～100 μg/kg質量分數范圍內的線性方程為y= 0.041 0+0.537 1x，R2=0.998 7；在100～1 000 μg/kg質量分數范圍內的線性方程為y=0.027 4+1.543 4x，R2= 0.999 6。其中，x表示目標待測物的相對濃度，y表示其對應的相對響應值。

2.3 準確度和精密度

以己烯雌酚陰性豬肉樣品作為基質，分別對10，50，100和500 μg/kg 4個添加質量分數按照上述試驗過程進行加標回收試驗，進行7次平行測定，該方法的回收率在86.3%～107.6%，SRSD在2.6%～12.4%。在重復性條件下獲得的2次獨立測定結果的絕對差值不超過算術平均值的20%。

3 結論

試驗通過對樣品前處理改進和儀器分析方法的優化，采用叔丁基甲醚作為提取劑，建立特異性的分析方法，實現對質控樣品及空白加標樣品中己烯雌酚的測定。相比于國內通用的檢測方法，試驗在滿足對回收率和精密度要求的前提下，不需要酶解過程，很大程度上簡化試驗步驟，大幅縮短前處理時間，且內標損失相對較小，有效提高回收率。該方法操作簡單、耗時短、回收率高、準確性好、檢測成本低，為快速檢測動物性食品中己烯雌酚提供有效的方法選擇。