保健食品中莧菜紅含量的測量不確定度評定

張敏

廣東省食品檢驗(yàn)所（廣東省酒類檢測中心）（廣州 510435）

隨著人們生活水平提高，保健食品作為一類具有保健功能的特殊食品，也越來越受到市場歡迎。在保健食品如片劑類、膠囊劑類產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，通常會(huì)添加莧菜紅、誘惑紅等色素以改善產(chǎn)品外觀。莧菜紅是一種常見的食品用人工合成著色劑，又稱食品用色素紅色素2號、C.I.酸性紅27、C.I.16185、FD及C紅2號、3-羥基-4-[（4-磺酸基-1-萘基）偶氮基]-2, 7-萘二磺酸三鈉鹽，屬于偶氮酸性水溶性染料[1]，同其他人工合成色素如檸檬黃、胭脂紅一樣，其色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于食品、保健食品、藥品、化妝品等的著色，起到改善產(chǎn)品色澤、增加美觀性、增進(jìn)食欲等效果[2]。然而，人工合成食品色素多由煤焦油、苯、萘等芳香化合物為原料制成。莧菜紅作為一種偶氮化合物，會(huì)在體內(nèi)經(jīng)代謝生成β-萘胺和α-氨基-1-萘酚等具有強(qiáng)烈致癌性的物質(zhì)[3]，若過量攝入會(huì)在體內(nèi)蓄積，對腎臟、肝臟產(chǎn)生一定傷害。近年來，市場監(jiān)管部門一直把該類著色劑納入監(jiān)管范圍，因此，對莧菜紅的檢測及確保結(jié)果準(zhǔn)確顯得尤為必要。

不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度。它是測量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)，會(huì)直接影響檢驗(yàn)結(jié)果。測量結(jié)果的不確定度可以提高檢測結(jié)果的可靠性。另外，不確定度評定也可以判定測量結(jié)果質(zhì)量的高低，影響判定檢驗(yàn)結(jié)果的合格與否[4-6]。參照GB 5009.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》[7]，采用高效液相色譜法測定保健食品（片劑類）中的莧菜紅含量，對測量結(jié)果進(jìn)行不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（壇墨公司，500 μg/mL，相對擴(kuò)展不確定度Ur=3%，k=2）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；乙酸銨（色譜純，F(xiàn)ISHER公司）；無水乙醇（分析純，廣試公司）；甲酸（分析純，光華公司）；氨水（分析純，光華公司）；聚酰胺粉（0.075 0～0.150 mm孔徑，即100～200目，國藥試劑公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Acquity Arc配有二極管陣列檢測器及empower數(shù)據(jù)處理軟件，美國沃特世公司）；電子天平（ME203，瑞士梅特勒-托利多公司）；可調(diào)移液器（J11005G，10～100 μL及L42224G，100～ 1 000 μL，德國艾本德公司）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Reference，德國密理博公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（配有冷卻循環(huán)系統(tǒng)，德國IKA公司）；離心機(jī)（ST8，美國賽默飛世爾公司）；單線標(biāo)容量瓶（10 mL和5 mL，均為A級，博美公司）。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別吸取0.01，0.02，0.10，0.20，0.40和1.00 mL莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（500 μg/mL），用一級水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標(biāo)液，上機(jī)測定，繪制峰面積-莧菜紅溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 測定方法

稱取10 g左右粉碎樣品，放入100 mL小燒杯中，加水30 mL，溫?zé)崛芙猓脵幟仕崛芤赫{(diào)至pH 6左右。樣品溶液加熱至60 ℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃ pH 4的水洗滌3～5次，用甲醇-甲酸混合溶液洗滌3～5次，用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，直至色素完全解吸，收集解吸液，水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5 mL。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)高效液相色譜儀分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱采用賽默飛Acquasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為乙酸銨溶液（0.02 mol/L）；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。梯度程序：A，15% 1.0 min，15%～60% 2.0 min，60%～80% 2.0 min，80%～15% 1.5 min，15% 5.5 min。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

樣品中莧菜紅含量X按式（1）計(jì)算。

式中：X為樣品中莧菜紅含量，mg/kg；C為樣品待測液中莧菜紅質(zhì)量濃度，μg/mL；V為最終定容體積，mL；m為樣品的稱樣量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

不確定度來源用因果圖表示，見圖1。

圖1 X的不確定度來源因果圖

2.2 不確定度評定

2.2.1 評定標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對不確定度評定

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（500 μg/mL，購自壇墨公司），查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，可知由莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對不確定度urel(C)為urel(C)=uC/C=7.5/500=0.015 0。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對不確定度評定

由1.3.1的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容過程中使用到100～1 000 μL可調(diào)移液器移取200，400和1 000 μL的體積，使用到10～100 μL可調(diào)移液器分別移取10，20和100 μL的體積，分別用10 mL單線標(biāo)容量瓶定容。查檢定證書可得，可調(diào)移液器的容量測量結(jié)果不確定度見表1，則100～1 000 μL可調(diào)移液器移取200，400和1 000 μL的容量允差相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.004/2=0.002，0.002/2=0.001和0.002/2=0.001；10～100 μL可調(diào)移液器移取10，20和100 μL的容量允差相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.020/2=0.010，0.020/2=0.010和0.004/2=0.002。

表1 可調(diào)移液器容量測量結(jié)果相對擴(kuò)展不確定度

根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》[8]，10 mL A級容量瓶在20 ℃的最大容量允差為±0.020 mL，按均勻分布（k=3），10 mL容量瓶容量允差的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)范圍為（20±5）℃，水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21 ℃-1，按均勻分布（k=3），環(huán)境溫度變化的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(T)=

由不確定度分量可得，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 評定標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

采用外標(biāo)法對6個(gè)不同濃度的莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定，上機(jī)測得相應(yīng)的峰面積，見表2，以最小二乘法擬合，得到莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度x和峰面積y的線性方程和相關(guān)系數(shù)。回歸方程為y=bx+a，其中b=23 161.28，a=1 643.933，相關(guān)系數(shù)r=0.999 989。

表2 莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測定結(jié)果

樣品待測液用高效液相色譜儀測定，得2份平行試樣積分峰面積，并計(jì)算樣品中莧菜紅含量，由X1與X2取均值，測得值為X，結(jié)果見表3。

表3 2份平行試樣積分峰面積及含量測定結(jié)果

按照J(rèn)JF 1035—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[9]計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘差標(biāo)準(zhǔn)差SR，結(jié)果為

標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Q)為

式中：n為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的總測量次數(shù)（n=6）；P為樣品重復(fù)測定次數(shù)（P=2）；c為樣品用該擬合曲線測定2次的濃度平均值；為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均濃度（=14.417 μg/mL）。

2.2.3 評定樣品稱量引入的相對不確定度

稱量樣品時(shí)天平室與干燥器為相同濕度，稱量時(shí)無吸潮。查JJG 1036—2008《電子天平》[10]得，試驗(yàn)中使用量程最大允許誤差的絕對值M P E V= 0.5e=0.005 g，按照均勻分布（k=3）計(jì)算，樣品稱樣量平均值為10.053 g，則稱量樣品質(zhì)量時(shí)由天平最大允許誤差引入的樣品質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 評定樣液定容引入的不確定度

u(V)由5 mL單線標(biāo)容量瓶引入，主要由允許誤差u允差(V)和溫差u溫差(V)線性疊加而得。

查JJG 196—2006得，5 mL A級單標(biāo)線容量瓶的允差為±0.020 mL，按三角分布估算，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

實(shí)驗(yàn)室溫度為25 ℃，容量瓶校準(zhǔn)時(shí)溫度為20 ℃，由于液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，可只考慮液體的體積膨脹，認(rèn)為供試液的體積膨脹系數(shù)與水近似，水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21 ℃-1，因此產(chǎn)生的體積變化半寬為5 mL×0.000 21 ℃-1×5 ℃=0.005 25 mL，按操作規(guī)程，體脹系數(shù)不作修正，此處按不確定度處理，假設(shè)溫度變化為矩形分布，則

由樣液定容引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(V)=

2.2.5 評定樣品測量重復(fù)性引入的不確定度

試驗(yàn)進(jìn)行6次重復(fù)測量，結(jié)果見表4。

表4 樣品中莧菜紅含量的重復(fù)測量數(shù)據(jù)表

則測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(R)=

2.2.6 評定加標(biāo)回收率引入的不確定度

在樣品中加入適量目標(biāo)分析物進(jìn)行3個(gè)水平（1.00，5.00和20.0 mg/kg）加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行測定2次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差。對回收率結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)），在95%置信區(qū)間，自由度為5時(shí)，t分布臨界值t0.95(5)=2.57，即當(dāng)檢驗(yàn)值t≥2.57時(shí)，樣品測量結(jié)果與回收率有顯著性差異，需使用回收率修正，反之則無需修正。結(jié)果見表5。

加標(biāo)回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和t值分別按式（3）和（4）計(jì)算。

由表5可知，t＜t0.95(5)，與回收率100%之間無顯著性差異，故無需修正結(jié)果。

表5 加標(biāo)回收率結(jié)果及相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品中的莧菜紅含量測定的不確定度分量見表6。

表6 樣品中的莧菜紅含量測定不確定度分量

對各不確定度分量進(jìn)行合成計(jì)算，則試驗(yàn)的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(x)=0.028 6 。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(x)=X×urel(x)=5.70×0.028 6=0.163 mg/kg。

2.4 評定擴(kuò)展不確定度

按照J(rèn)JF 1135—2005和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[11]的要求，一般測量可以取k=2，則樣品中的莧菜紅含量測定的擴(kuò)展不確定度為U=u(x)×k=0.163×2=0.326 mg/kg。擴(kuò)展不確定度有效位數(shù)最多為2位，且給定的測量結(jié)果位數(shù)和不確定度位數(shù)應(yīng)一致，修約一般采用只進(jìn)不舍的原則，則測量保健食品中莧菜紅含量的結(jié)果為5.70±0.33 mg/kg，k=2，相對擴(kuò)展不確定度為Ur=5.8%。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法測定保健食品（片劑類）中莧菜紅含量，進(jìn)行不確定度評定，分析6種不確定度來源并計(jì)算各分量，由結(jié)果可知，各測量不確定度分量中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制影響最大，其次為加標(biāo)回收率，接著是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及樣品測量重復(fù)性，樣液定容和樣品稱量的影響最小。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度主要來源于標(biāo)物本身及稀釋過程，可考慮更換純標(biāo)準(zhǔn)品，或標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋時(shí)增加配制體積；樣品處理過程相對復(fù)雜，需經(jīng)過提取、凈化、富集、濃縮、復(fù)溶等步驟，聚酰胺粉的產(chǎn)品質(zhì)量亦會(huì)影響目標(biāo)物的洗脫效果，導(dǎo)致回收率波動(dòng)較大，從而影響測量結(jié)果不確定度，可進(jìn)一步優(yōu)化前處理方法，如增加樣品提取次數(shù)、使用聚酰胺固相萃取小柱替代聚酰胺粉等，以提高回收率。此外，還可通過增加標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的測量次數(shù)及樣品重復(fù)測量次數(shù)等手段減少測量過程中的不確定度，保證結(jié)果準(zhǔn)確性。