特殊醫學用途全營養配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的測定

楊濤，韋偉寧，原亞梅，陸業活，鄧愛婕，滕丕合

廣西弘山堂生物科技有限公司（南寧 530032）

特殊醫學用途配方食品（Food for Special Medical Purposes，FSMP）簡稱特醫食品，是指為了滿足進食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態人群對營養素或膳食的特殊需要，專門加工配制而成的配方食品[1]。特殊醫學用途配方食品分為全營養配方食品、特定全營養配方食品和非全營養配方食品，該類產品必須在醫生或臨床營養師指導下，單獨食用或與其他食品配合食用，其中特殊醫學全營養配方食品可作為單一營養來源滿足目標人群的營養需求[2]。

亞油酸的學名是9, 12-十八碳二烯酸，其化學式為C18H32O2，為無色油狀液體，不溶于水，易溶于石油醚、甲苯等有機溶劑。由于人體無法合成亞油酸，必須通過食物額外補充或通過特定的前體物質形成來維持正常的生理功能，被稱為人體必需脂肪酸[3]。膽固醇與亞油酸結合才能發揮正常的轉運功能，人體一旦缺乏就可能引發代謝障礙，演變成動脈粥樣硬化，從而引發心腦血管疾病[4]。α-亞麻酸為順9，順12，順15-十八碳三烯酸，化學式為C18H30O2，是ω-3系列的必需脂肪酸，必需從體外攝取[5]。人體一旦缺乏，就可能導致自身免疫力下降、疲勞等癥狀的發生，特別是嬰幼兒和青少年，如果在成長期間長期缺乏亞麻酸，會嚴重影響智力的正常發育[6]。

食品安全國家標準GB 29922—2013中規定適用于10歲以上人群的全營養配方食品中亞油酸的供能比應不低于2.0%；α-亞麻酸供能比應不低于0.5%，是特殊醫學用途全營養配方食品中的必檢項目[1]。特殊醫學用途全營養配方食品成分復雜、組織狀態多樣、亞油酸和α-亞麻酸含量較低等因素都會給檢測帶來較大的難度，目前特殊醫學用途全營養配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的含量測定方法也未見報道。此次研究擬建立特殊醫學用途全營養配方食品中亞油酸和α-亞麻酸含量測定方法，為本產品的質量控制提供有力的保障，也為特殊醫學用途配方食品行業提供一定的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞油酸甘油三脂（純度≥99.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；α-亞麻酸甘油三脂（純度≥ 99.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲苯（美國Fisher公司）；甲醇（美國Honeywell公司）；乙酰氯（德國Merck公司）；無水碳酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；有機微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

試驗用特殊醫學用途全營養配方食品來源于本公司研發設計。

1.2 儀器與設備

GC-2010 Pro氣相色譜儀（日本島津公司）；SPB-3全自動空氣源和SPH-300氫氣發生器（北京中惠普分析技術研究所）；MS3渦旋振蕩器（IKA公司）；DCY-12S水浴氮吹儀（紹興蘇珀儀器有限公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（方科儀器常州有限公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）；H1850高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

亞油酸甘油三脂和α-亞麻酸甘油三脂混合儲備液：分別稱取亞油酸甘油三脂144.5 mg（精確到0.1 mg）和α-亞麻酸甘油三脂63.5 mg（精確到0.1 mg），用甲苯溶解，定容至10 mL的容量瓶中。于-10 ℃以下的冰箱中保存，有效期3個月。

混合標準系列工作液：分別準確吸取亞油酸甘油三脂和α-亞麻酸甘油三脂混合標準儲備液0.05，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 mL，于15 mL干燥螺口玻璃管中，分別加入4.95，4.90，4.80，4.50，4.00和3.00 mL的甲苯。向試樣中加入10%乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮氣后，旋緊螺旋蓋。振蕩混合后于80±1 ℃水浴中放置2 h，期間每隔20 min取出振搖1次，水浴后取出冷卻至室溫。將反應后的樣液轉移至50 mL離心管中，分別用3 mL 6%的碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸鈉溶液于50 mL離心管中，混勻。以5 000 r/min離心5 min，取上清液經濾膜過濾后上機。

1.3.2 樣品處理

試樣測定液：稱取混合均勻的特殊醫學用途全營養配方食品試樣約0.5 g（精確到0.1 mg），于15 mL干燥的螺口玻璃管中，加入5.0 mL的甲苯，混合均勻后向試樣中加入10%的乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮氣后，旋緊螺旋蓋，振蕩混合后于80±1 ℃水浴中放置2 h，期間每隔20 min取出振搖1次，水浴后取出冷卻至室溫。將反應后的樣液轉移至50 mL離心管中，分別用3 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸鈉溶液于5 mL離心管中，混勻。以5 000 r/min離心5 min，取上清液經濾膜過濾后上機。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：島津SH-Rtx-Wax毛細管柱，長度30 m，內徑0.32 mm，膜厚0.5 μm。進樣口溫度270 ℃，檢測器溫度280 ℃，柱溫控制采用程序升溫，130 ℃為起始溫度，以15 ℃/min升溫至180 ℃，持續5 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃，持續2 min，以4 ℃/min升溫至230 ℃，持續10.5 min。載氣為N2，尾吹氣流量30 mL/min，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min。進樣體積1 μL，分流比100∶1。

2 結果與分析

2.1 樣品處理方法

對脂肪酸的含量進行測定時，首先需要提取樣品中的脂肪酸并進行甲酯化處理[7]。水解提取法是指樣品經水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在堿性條件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯[8]；乙酰氯-甲醇法是指乙酰氯與甲醇反應得到鹽酸-甲醇使其中的脂肪和游離脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，進行分離檢測[9]；酯交換法是指將油酯溶解在異辛烷中，加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化，反應完全后，用硫酸氫鈉中和剩余氫氧化鉀，測定脂肪酸含量[10]。其中水解提取法過程繁雜、步驟較多、檢測周期長，不適合大量樣品的檢測；酯交換法中氫氧化鉀不能使樣品中游離的脂肪酸及其鹽甲酯化，適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂樣品；亞油酸和α-亞麻酸以包埋的形式添加到本樣品中，且水分含量為3.42%，乙酰氯-甲醇法適用于含水量小于5%的乳粉試樣，對脂肪酸以包埋形式添加的樣品有更好的提取效率，能很大程度上提高檢測分析的準確度[11]。因此文章采用乙酰氯-甲醇法進行樣品的前處理，下圖1為亞油酸和α-亞麻酸混合對照氣相色譜圖，圖2為特殊醫學用途全營配方食品氣相色譜圖。該方法空白樣品無其他雜質的干擾，亞油酸和α-亞麻酸的分離度達到8.21，均能滿足試驗要求。

圖1 亞油酸和α-亞麻酸混合對照氣相色譜圖

圖2 特殊醫學用途全營養配方食品樣品氣相色譜圖

2.2 線性范圍和定量限

將1.3.1小節中配制的混合標準系列工作液按濃度由低到高的順序依次經氣相色譜儀進行測定，以各組分的進樣質量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），分別繪制標準曲線。在0.72～28.61 mg范圍內亞油酸的回歸方程為Y=38 433.85X-36 830.88，R2= 0.996 3具有良好的線性關系，在0.31～12.56 mg范圍內α-亞麻酸的回歸方程為Y=39 580.66X-15 560.57，R2=0.997 0呈現良好的線性關系。按1.3.2小節的方法處理樣品后，以信噪比法（S/N≥10）來確定該方法的定量限，其中亞油酸的定量限為4.62 mg/100 g，α-亞麻酸的定量限為3.84 mg/100 g。下圖3為亞油酸標準曲線圖，圖4為α-亞麻酸標準曲線圖。

圖3 亞油酸線性方程

圖4 α-亞麻酸線性方程

2.3 精密度

取特殊醫學用途全營養配方食品試樣約0.5 g，按照1.3.2小節中的方法處理，平行制備7份，亞油酸甲酯轉化為亞油酸的換算系數為0.956 7，α-亞麻酸甲酯轉化為α-亞麻酸的換算系數為0.956 4，通過計算，氣相色譜分析結果見下表1。亞油酸含量的平均值3.63 g/100 g，7份的相對標準偏差為1.27%；α-亞麻酸含量的平均值為0.37 g/100 g，7份的相對標準偏差為1.16%。亞油酸和α-亞麻酸含量的比值接近10∶1，與試樣設計的理論比例一致，兩者的相對標準偏差均小于2.0%，表明該方法試驗結果準確，精密度良好。

表1 精密度試驗結果

2.4 回收率

將精密度試驗測得樣品亞油酸和α-亞麻酸的平均值作為樣品含量，設計50%，100%和150%三個水平的加標質量分數。亞油酸加標：準確稱取樣品約100 mg，在加入樣品的同時分別準確吸取混合標準系列工作液0.1，0.2和0.3 mL每個水平平行制備3份，共9份，按1.3.2小節中的方法處理；α-亞麻酸加標：準確稱取樣品約500 mg，在加入樣品的同時分別準確吸取混合標準系列工作液0.1，0.2和0.3 mL每個水平平行制備3份，共9份，按1.3.2小節中的方法處理。亞油酸的平均回收率為97.68%，9份的相對標準偏差為1.14%；α-亞麻酸的平均回收率為100.69%，9份的相對標準偏差為1.47%，均符合GB/T 27404—2008中附錄1關于回收率的要求，表明該方法準確度良好[12]。表2為加標回收率試驗結果。

表2 加標回收率試驗結果

3 結論

特殊醫學用途全營養配方食品作為長期單一營養來源時，能夠滿足目標人群每日的營養需求，是臨床腸內營養治療的重要組成部分，我國特醫食品行業還處于早期的起步階段，潛力巨大，是大健康領域的又一片藍海[13]。雖然國家對企業的研發能力、生產能力、檢驗能力等產品注冊相關條件設置了較高的準入門檻，但是也阻擋不了國內越來越多的企業進入這一行業的熱情。亞油酸和α-亞麻酸都是人體必需脂肪酸，亞油酸在體內能轉化為花生四烯酸，對于形成細胞結構、維持組織生理功能、合成磷脂等均具有重要作用[14]。α-亞麻酸在進入人體后在碳氫酶和碳鏈延長酶的作用下，在人體代謝中衍生為EPA和DHA等，有利于預防和治療外周動脈等相關疾病[15]。α-亞麻酸完全靠從飲食中攝取，若攝取不足可能會導致心力衰竭等疾病[16]。特殊醫學用途全營養配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的供能比均有國家標準規定，屬于必檢項目，目前特殊醫學用途全營養配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的含量測定方法也未見報道。試驗建立了氣相色譜法同時分離檢測特殊醫學用途全營養配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的檢驗方法。亞油酸出峰時間為14.21 min，α-亞麻酸的出峰時間為15.36 min，空白樣品對檢測無干擾，兩者的分離度為8.21達到檢測要求。亞油酸、α-亞麻酸分別在0.72～28.61 mg（R2=0.996 3）、0.31～12.56 mg（R2=0.997 0）范圍內線性關系良好，亞油酸的線性方程為Y=38 433.85X- 36 830.88，α-亞麻酸的線性方程為Y=39 580.66X- 15 560.57。以10倍的信噪比計算方法定量限，亞油酸的定量限為4.62 mg/100 g，α-亞麻酸的定量限為3.84 mg/100 g。平行制備7份樣品，樣品中亞油酸和α-亞麻酸的含量分別為3.63和0.37 g/100 g，含量的相對標準偏差分別為1.27%和1.16%。設計50%，100%和150%三個水平的加標質量分數，每個水平平行測定3次，亞油酸的平均回收率為97.68%，9份的相對標準偏差為1.14%，α-亞麻酸的平均回收率為100.69%，9份的相對標準偏差為1.47%。綜上所述，該方法基質干擾小、操作易行、精密度高、準確度好，適用于特殊醫學用途全營養配方食品中亞油酸和α-亞麻酸的測定，能為本產品質量控制提供一定的科學依據。