液質聯用法測定南美白對蝦中84種農藥殘留

項愛麗，段曉然，馬瑞欣，張誼，湯思凝*，周鑫*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省水產技術推廣總站（石家莊 050000）

水產品的質量安全問題日益受到政府、消費者的關注[1]。水產品中的漁藥殘留、毒素類、重金屬等物質超標，可能對人體健康產生不利影響，因此這些化學污染物受到廣泛監測或控制[2-5]。近年來，動物源性食品中的農藥、殺蟲劑等藥物殘留受到廣泛重視[6-8]，GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》增加動物源性食品農藥殘留限量的食品種類和藥物種類。水產品中的農藥殘留可能來源于混合養殖模式的推廣[6]、降雨降水、陸地徑流和大氣循環等途徑[9]。這些藥物通過大氣、水文和農業生態系統進入食物鏈，可能間接威脅人類健康[10]。然而，對動物源性食品中的農藥殘留的研究并不甚多。

農藥殘留的分析方法以氣相色譜-質譜法（GCMS/MS）和液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）技術應用最廣[11-12]。超高效液相色譜串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）具有抗干擾能力強、靈敏度高、檢測效率高等優點[13]。SCRS固相萃取柱，是在QuEChERS方法基礎上開發出的對樣品提取液進行凈化的前處理耗材，能實現單步凈化[14]。

試驗建立固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法，對南美白對蝦中的農藥多殘留進行測定方法的開發，通過優化樣品前處理的操作條件和儀器參數，實現快捷高效、準確可靠測定84種農藥殘留的目的，為實驗室測定水產品中農藥殘留提供方法支持，對評估農藥殘留對水產品的風險、持續監測水產品中殘留物和進一步評估對人體健康危害提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈、甲醇（色譜純，Dikma公司）；甲酸（色譜純，Thermo Fisher公司）；二甲基亞砜（DMSO）、氯化鈉（國產優級純）；試驗用水為超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）。

SCRS固相萃取柱（天津賽恩博瑞科技有限公司）；微孔濾膜（0.22 μm），親水性聚四氟乙烯（WWPTFE）膜，PALL公司。

84種農藥殘留標準品（天津阿爾塔公司）。

1.2 標準溶液配制

準確吸取適量農藥標準品，用乙腈稀釋并定容，配制成1 μg/mL的農藥混合標準溶液，在-18 ℃條件下保存。

1.3 儀器與設備

液相色譜串聯質譜儀（配電噴霧離子源（ESI），Triple Quad 5500+，美國AB SCIEX公司）；離心機（Thermo Sorvall RC-6 Plus，美Thermo Fisher公司）；超聲清洗儀（KQ-800KDB型，昆山市超聲儀器有限公司）；多位渦旋儀（Multi Reax，德國Heidolph公司）。

1.4 前處理方法

稱取2 g（精確至0.001 g）勻漿蝦肉試樣于50 mL離心管中，加入10 mL 80%乙腈水溶液，渦旋混勻，振蕩提取5 min，超聲提取10 min。加入1.0 g氯化鈉，渦旋混合2 min，按4 000 r/min離心5 min，乙腈層經SCRS萃取柱凈化后，取4 mL乙腈凈化液置于10 mL離心管并加入50 μL DMSO，于40 ℃氮氣吹掃，10%乙腈水溶液定容至1 mL，混勻過0.22 μm濾膜，待上機分析。

1.5 液相色譜條件

Kinetex F5液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，phenonenex公司）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相A為水（含0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨），流動相B為甲醇（含0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨）。洗脫方式為梯度洗脫，洗脫條件：0.0～1.0 min，97% A；1.0～1.5 min，97% A降至85% A；1.5～2.5 min，85% A降至50% A；2.5～10.0 min，50% A下降到30% A；10.0～13.0 min，30% A下降到2% A；13.0～17.0 min，保持2% A；17.0～17.1 min，2% A上升至97% A；17.1～20.0 min，保持97% A。

1.6 質譜條件

離子源：電噴霧正電離模式（ESI+）。檢測方式：多反應監測（MRM）。氣簾氣（CUR）30 psi；霧化氣（GS1）45 psi；輔助氣（GS2）45 psi；碰撞氣（CAD）9；源溫500 ℃；噴霧電壓（IS）5 500 V；入口電壓（EP）10 V。目標化合物監測離子對和碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）參數見表1。

表1 化合物的選擇離子及質譜參數

接表1

2 結果與討論

2.1 儀器條件優化

根據84種農藥的理化性質及其相應的母離子，通過儀器軟件優化母、子離子信息，選擇信號強度大、穩定性高的離子碎片作為定量離子和定性離子，并以此為基礎，對離子源參數和去簇電壓、碰撞能量等參數進行優化，以多反應監測為檢測方式，使目標化合物的離子化達到最佳的水平。

液相色譜方法對目標化合物[15]的定性定量分析有很大的影響，體現在保留時間、基質效應、色譜峰型等方面[16]。在流動相的選擇上，有機相分別考察甲醇和乙腈，水相比較純水、甲酸水、甲酸銨水溶液、乙酸銨水溶液等對梯度洗脫和目標化合物色譜行為的影響。因質譜端掃描應用的是ESI+模式，在流動相中加入低濃度的甲酸，以提供H+，有利于在正掃描模式下目標化合物形成[M+H]+形式的母離子，增強離子化效果；流動相中加入甲酸銨，有利于各物質間的色譜分離和改善色譜峰型。通過試驗對比，最終選取水和甲醇作為洗脫溶劑，兩者均加入0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨，以保持在一定流速下甲酸和甲酸銨的比例穩定不變。84種農藥的MRM掃描色譜圖見圖1。

圖1 84種農藥的MRM掃描色譜圖

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取試劑

基于涉及的農藥種類較多，其極性、溶解性等理化性質不盡相同，且蝦肉的基質成分比較復雜，考察乙腈、乙酸乙酯等常用的針對動物源性基質的藥物殘留提取試劑[17]對目標化合物的提取效果，并對回收率進行分析，結果見圖2。使用80%乙腈作為提取試劑時，回收率在80%～120%的農藥數量為65種，占總農藥數量的77.4%；分別應用甲醇和乙酸乙酯作為提取試劑，農藥最終回收率小于80%的占比分別為91.7%和53.6%。比較常見的提取試劑中添加甲酸、乙酸，使提取條件呈酸性[18]，在80%乙腈中分別添加1%和5%的甲酸，有20種和19種農藥落入回收率低于60%的區域。綜上，選用80%乙腈作為提取試劑，在處理過程中收取良好的蛋白沉淀效果，并得到目標化合物回收率的保證。

圖2 提取試劑對回收率的影響

2.2.2 氮吹條件

氮氣吹掃是藥物殘留定性定量分析中常用的濃縮方式[19]。氮氣吹掃的過程可能會影響最終的定量準確性。試驗考察凈化提取液直接氮氣吹掃至干、凈化提取液中加入DMSO吹掃、凈化提取液中加入DMSO吹掃至干3種情況，結果見圖3。在3種條件下，藥物回收率沒有明顯的區別，考慮到氮吹后復溶定容等操作便捷性，選取在凈化液中加入DMSO進行氮氣吹掃。

圖3 氮吹條件對回收率的影響

2.2.3 復溶液成分

樣品提取液經濃縮后，復溶步驟采用的試劑種類不一[20-21]，不同的試劑對儀器響應值和回收率有著影響[13]。試驗選擇10%乙腈、30%乙腈和10%乙腈（含1%甲酸）3種復溶液對氮吹殘留物進行處理，經儀器分析，選擇30%乙腈作為試驗復溶試劑，結果見圖4。

圖4 復溶液對回收率的影響

2.3 基質效應的考察

蝦肉中富含蛋白質、脂肪、礦物質等物質致使樣品成分復雜。選用電噴霧離子源，因其特殊的結構特點和電離機理，如果在樣品前處理過程中凈化效果不佳，會產生影響目標化合物響應強度和定量分析的基質抑制效應[22-23]。在凈化過程中，使用SCRS固相萃取柱對提取液中的雜質進行吸附，經SCRS濾過的提取液，通過超高效液相色譜串聯質譜分析，得到84種農藥殘留的基質效應數據，對農藥基質效應的強弱進行區域劃分[24]，見圖5?；|效應落入[80%，100%]區間的農藥數量為50種，落入[100%，120%]區間的農藥數量為31種，96.4%的農藥經試驗的前處理后經質譜分析，表現為弱基質抑制效應，表明前處理方法去除雜質能力較強，凈化效果良好。雖然基質效應的影響不大，為尋求更精準的定量分析結果，仍選用空白基質加標的方法對目標化合物進行定性定量分析。

圖5 84種農藥基質效應區間分布

2.4 定量限、回收率和精密度

以南美白對蝦空白基質提取溶液配制基質標準曲線對樣品進行定量分析，并采用低濃度加標于空白基質樣品，計算信噪比得到方法定量限（limits of quantification，rSN=10）[25]，84種農藥的定量限為1～10 μg/kg。針對于方法準確性和穩健性，考察方法的回收率和精密度。選取空白南美白對蝦樣品進行標準添加，低、中、高3個添加水平（設置含量水平為5，10和50 μg/kg），每個水平做6個平行樣，進行前處理和上機儀器分析。經計算得出各種藥物在低、中、高3個添加水平的回收率分別為62.4%～127.1%，58.0%～121.6%和51.9%～132.2%，精密度分別為0.13%～ 11.04%，0.69%～8.42%和0.29%～8.11%。

2.5 實際樣品測定

抽取35批市售南美白對蝦樣品，依照建立的試驗方法，對84種農藥殘留進行測定分析。分析結果顯示，抽取的南美白對蝦樣品中，有4批樣品檢出西草凈，含量范圍為8.16～14.61 μg/kg，未檢測到其他農藥殘留。

3 結論

試驗建立快速測定南美白對蝦中的84種農藥殘留的固相萃取-液相色譜串聯質譜分析方法。試樣用80%乙腈提取，通過鹽析使乙腈與水相分層，利用SCRS快速固相萃取吸附雜質進行凈化，超高效液相色譜串聯質譜分析檢測，基質標定量。試驗方法簡單快捷，準確穩健，能夠對南美白對蝦樣品中84種農藥殘留進行定性定量分析，為檢測南美白對蝦以至其他水產品中農藥殘留提供方便、可靠的實驗室方法。