高效液相色譜法測定牛奶及奶粉中免疫球蛋白含量

任意

上海市營養食品質量監督檢驗站/上海源本食品質量檢驗有限公司（上海 200090）

隨著時代的發展和生活水平的提高，人們越來越注重食物本身的營養價值和作用，同時隨著新冠疫情的常態化，增強免疫、提高免疫力成為大家共有的目標。牛奶中除了含有豐富的營養物質之外，還含有眾多免疫活性物質，有益人體健康，因此越來越多的人將牛奶列為每日必需品。此外，市面上還有一些宣稱具有增強免疫功能的奶粉，添加免疫球蛋白、乳鐵蛋白等免疫活性物質，以此吸引消費者購買。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）就是上述免疫活性物質之一，它是一種具有抗體活性或化學結構與抗體分子相似的球蛋白，為Y字型結構，根據電泳遷移率和免疫功能不同，可分為IgG、IgA、IgD、IgE、IgM。其中，IgG又可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG44個亞類，IgA可分為IgA1和IgA22個亞類，IgM可分為IgM1和IgM22個亞類。IgG是牛初乳中主要的免疫活性物質，具有抗菌、抗病毒、抗毒素等多種免疫活性[1-3]。

我國現行實施的測定免疫球蛋白的標準有針對保健品和飼料的高效親和色譜法、牛初乳及其制品的分光光度法和酶聯免疫法，其中高效親和色譜法和酶聯免疫法比較常用。酶聯免疫法反應靈敏，操作過程中稍有差池就會影響結果[4]，而高效親和色譜法除了基質針對的是保健品和飼料外，所使用的色譜柱不耐壓、易漏液[3]，并且乳及乳制品中含有脂肪和蛋白質，去除不干凈會污染檢測器且干擾較大，影響定量。試驗參考高效親和色譜法，通過HiTrapTMProtein G HP親和柱結合免疫球蛋白，采用C18色譜柱進行分離，對牛奶及奶粉中免疫球蛋白的測定進行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀（配SPD-M20A二級陣列管檢測器，日本島津）；HiTrapTMProtein G HP親和柱（美國GE）；CAPCELL PAK C18色譜柱（SG300，4.6 mm×250 mm，5 μm，日本大曹三耀）；Master-D純水機（上海和泰）；BSA323S電子天平（精度0.001 g，德國賽多利斯）；CF16RN冷凍離心機（日本日立）；SK5200BT超聲波清洗器（上海科導）；BE-2600多管渦旋混合儀（江蘇海門市其林貝爾）；0.45 μm水相針式濾器（聚醚砜，上海安譜）；0.45 μm親水PTFE針式濾器（上海安譜）。

磷酸二氫鉀、甘氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、乙醇等（均為分析純）；三氟乙酸、乙腈（均為色譜純）；所有試驗用水為18.2 MΩ·cm去離子水。

0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）[5]：稱取6.80 g磷酸二氫鉀，加水溶解，用1 mol/L氫氧化鈉調整溶液pH至6.7，定容至1 L。

0.05 mol/L甘氨酸鹽緩沖液（pH 2.5）：稱取3.75 g甘氨酸，加水溶解，用鹽酸調整溶液至pH 2.5，定容至1 L。

牛免疫球蛋白G（IgG）標準品（北京美正）：8.5 mg/mL。用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液配制成500 μg/mL IgG標準儲備液。

超高溫滅菌乳、普通奶粉（市售）。

1.2 樣品前處理

準確稱取20 g牛奶、2 g奶粉（精確至0.001 g）于50 mL刻度離心管中，加入適量0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）（奶粉樣品可置于不超過35 ℃的溫水中進行溶解），振蕩混勻，超聲提取30 min，冷卻后定容至刻度，搖勻，按10 000 r/min冷凍離心10 min。取適量中間液再次按10 000 r/min冷凍離心10 min，取中間液備用。

HiTrapTMProtein G HP親和柱預先用水和0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液各10 mL活化，取4 mL備用中間液，通過親和柱進行凈化，用10 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液淋洗，用10 mL 0.05 mol/L甘氨酸鹽緩沖液洗脫，先棄去前0.5 mL，收集2.5 mL洗脫液，混勻后上液相色譜進行分析，剩余洗脫液全部棄去。親和柱用水淋洗后封存在20%乙醇中4 ℃保存，可反復使用多次。

1.3 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18色譜柱（SG300，4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：V乙腈∶V0.1%三氟乙酸= 5∶5。流速1.0 mL/min；柱溫采用室溫；進樣量10 μL；檢測波長280 nm；運行時間10 min。IgG標準品色譜圖和加標樣品色譜圖見圖1。

圖1 IgG標準品色譜圖（左）及加標樣品色譜圖（右）

1.4 標準曲線的繪制

準確吸取0.050，0.100，0.250，0.500，1.000，1.500和2.000 mL 500 μg/mL IgG標準儲備液，用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液定容至5 mL，得到質量濃度為5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，150.0和200.0 μg/mL的標準工作液。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

2.1.1 洗脫液接收體積

試驗中分別對0～0.5，0.5～2.5，2.5～3.0和3.0～3.5 mL洗脫液進行接收，上機進行分析。由圖2可以看出，前0.5 mL和3.0～3.5 mL沒有目標物質，2.5～3.0 mL有少量目標物質，因此在洗脫液接收時，棄去前0.5 mL，收集后2.5 mL就能保證目標物質完全接收。

圖2 洗脫液接收體積分析

2.1.2 濾膜的選擇

分別選取材質為聚醚砜和聚四氟乙烯的0.45 μm濾膜對標準溶液進行過濾分析，結果發現在相同條件下，通過聚醚砜材質水相濾膜的標準品峰面積與直接進樣的標準品峰面積相比基本相近，而通過聚四氟乙烯材質濾膜的標準品峰面積則損失44%。因此上機檢測時，如洗脫液過于渾濁，可以采用聚醚砜材質水相濾膜進行過濾；對于不渾濁的洗脫液，也可以直接混勻后上機檢測。

2.2 儀器條件的選擇

在流速、柱溫、進樣量相同的條件下，選取不同比例的流動相進行分析。由表1可得，當乙腈∶0.1%三氟乙酸3∶7時，IgG沒有出峰，當比例為7∶3，6∶4，5∶5和4∶6時，IgG均有出峰，且在5∶5時標準品峰面積最大。此外，結合高旭等[6]研究表明，柱溫過高時，IgG熱穩定性會降低，導致峰面積減小。因此選擇乙腈∶0.1%三氟乙酸比例5∶5、柱溫采用室溫的儀器條件。

表1 流動相比例對標準品峰面積的影響

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

將IgG標準工作溶液由低質量濃度到高質量濃度依次進樣，獲得不同質量濃度下的峰面積，以峰面積為橫坐標，質量濃度為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸。回歸方程為Y=0.001 548 27X+2.125 33，相關系數R2=0.999 6，線性范圍為5～200 μg/mL，線性關系良好，見圖3。

圖3 IgG標準曲線

牛奶稱樣量20 g時，以3倍信噪比（S/N）計算得檢出限為10.0 mg/kg，以10倍信噪比（S/N）計算得定量限為30.0 mg/kg；奶粉稱樣量2 g時，計算得檢出限為100 mg/kg，定量限為300 mg/kg。

2.4 回收率和精密度試驗

分別對超高溫滅菌乳和奶粉進行3個加標水平的基質加標回收試驗，并做6份平行試驗，計算平均回收率和相對標準偏差，結果見表2，回收率在92.4%～ 98.0%之間，相對標準偏差（SRSD，n=6）在0.914%～ 1.52%之間。結果表明試驗具有良好的精密度和準確度。

表2 2種基質的加標回收和精密度試驗結果

3 結論

用親和柱結合免疫球蛋白，C18色譜柱進行分離，對牛奶及奶粉中免疫球蛋白的測定進行研究。相關系數R2為0.999 6，牛奶基質檢出限為10.0 mg/kg，定量限為30.0 mg/kg；奶粉基質檢出限為100 mg/kg，定量限為300 mg/kg。回收率為92.4%～98.0%，相對標準偏差為0.914%～1.52%。該方法精密度良好、準確度高，可適用于牛奶及奶粉中IgG含量的測定。