魚腥草抗氧化應(yīng)激機(jī)制研究進(jìn)展

楊亞軍，曲靜，苗貴東

1. 興義民族師范學(xué)院體育學(xué)院（興義 562400）；2. 上海體育學(xué)院運(yùn)動科學(xué)學(xué)院（上海 200438）；3. 興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院（興義 562400）

魚腥草（Houttuynia cordataThunb，HCT）屬三白草科植物蕺菜，主產(chǎn)于日本、韓國、中國西南部。HCT作為根莖葉類蔬菜植物，藥食同源，HCT及其提取物具有抗氧化[1]、抗病毒[2]、抗炎[3]，抗衰老[4]、抗腫瘤[5]等作用。HCT提取物槲皮素能有效抑制Ⅱ型登革病毒[2]。HCT顯著降低高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老標(biāo)準(zhǔn)物的表達(dá)，發(fā)揮抗衰老作用[4]，魚腥草多糖（Houttuynia cordata polysaccharide，HCP）可減少脂多糖誘導(dǎo)慢性炎癥大鼠肺組織炎癥，改善肺水腫[2]。研究發(fā)現(xiàn)，HCT及其提取物的抗衰老、抗癌、抗炎作用與抗氧化有關(guān)[2,5-6]，HCP能顯著提高脂多糖誘導(dǎo)的慢性炎癥大鼠細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，發(fā)揮其抗氧化作用[2]。在以秀麗線蟲為動物模型的抗衰老研究中發(fā)現(xiàn)，HCT提取物顯著降低突變型線蟲活性氧（reactive oxygen species，ROS），增強(qiáng)應(yīng)激抵抗，延長其壽命[5]，HCT能有效降低苯并（a）芘誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，保護(hù)細(xì)胞免受苯并（a）芘誘導(dǎo)的DNA損傷和炎癥[6]。過氧化參與糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等諸多臨床疾病，針對抗過氧化相關(guān)反應(yīng)機(jī)制的研究對治療相應(yīng)疾病具體重要意義。在概述HCT抗過氧化生理作用的基礎(chǔ)上，綜述近年來魚腥草抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制，包括減輕體內(nèi)外氧化應(yīng)激反應(yīng)及信號通路調(diào)控，為HCT治療緩解氧化應(yīng)激疾病的研究提供視角。

1 HCT抗氧化作用

機(jī)體依賴抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（CAtalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR），清除過量自由基，保持穩(wěn)態(tài)。氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，引起細(xì)胞和組織內(nèi)的病理變化[7]。HCT中分離鑒定出220種化合物，其主要活性成包括黃酮類、揮發(fā)油、HCP、生物堿[8]，它們均可增強(qiáng)抗氧化酶活性，清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用。

1.1 HCT黃酮抗氧化作用

研究發(fā)現(xiàn)HCT黃酮能夠清除氧自由基，提高抗氧化酶活性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性。細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)，HCT黃酮具有較好的抗氧化作用，HCT水提物總黃酮和多酚，能夠提高小鼠成肌C2C12細(xì)胞SOD活性，逆轉(zhuǎn)由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降[9]。動物試驗發(fā)現(xiàn)，高劑量（160 mg/kg體重）HCT總黃酮灌胃能顯著提高由四氧嘧啶誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠血SOD含量，改善其糖耐量[10]。槲皮苷、槲皮素和金絲桃苷作為HCT黃酮的主要組成成分，能顯著降低四氯甲烷誘導(dǎo)的急性肝中毒小鼠肝丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量水平，提高血清谷胱甘肽轉(zhuǎn)換酶（glutathione s-transferase，GST）、SOD、CAT水平[11]。此外，HCT分離出的槲皮素、槲皮素苷抑制脂質(zhì)過氧化，具有明顯的劑量依賴性，且糖基化的槲皮素苷比槲皮素表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[12]。

1.2 HCT揮發(fā)油抗氧化應(yīng)激作用

揮發(fā)油是HCT最重要的藥效成分之一，動物試驗中，HCT揮發(fā)油能夠顯著升高去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠血清SOD活性，顯著降低血清MDA含量，并呈劑量依賴性[13]。活性氧清除方面，HCT揮發(fā)油能降低脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生和NO合成酶（nitric oxide synthase，iNOS）蛋白的合成[14]。癸酰乙醛（魚腥草素）是其發(fā)揮抗氧化的主要物質(zhì)，魚腥草素不穩(wěn)定，常與亞硫酸氫鈉化合形成魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate，SH），病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，SH能夠降低脂多糖誘導(dǎo)的肺組織損傷小鼠肺細(xì)胞MAD水平，提高SOD水平，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[15]。

1.3 HCP抗氧化應(yīng)激作用

HCP通過清除自由基、提高抗氧化酶活性，起到抗氧化作用。從魚腥草葉中所分離出的甘露糖、半乳糖、葡萄糖，具備DPPH·清除能力，但清除能力不及維生素C，同時能夠螯合Fe2+，還原鐵氰化鉀，表現(xiàn)出抗氧化作用[16]。體內(nèi)試驗表明，通過每周1次持續(xù)6周灌服不同劑量（50，100和200 mg/kg體重）HCP溶液，能夠顯著提高脂多糖誘導(dǎo)的慢性炎癥大鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px含量，且除了50 mg/kg體重組，其余劑量組MDA含量顯著降低，提升肝組織抗氧化能力[4]。HCP抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠支氣管肺NO的產(chǎn)生[17]。

1.4 HCT提取液抗氧化作用

HCT無論是水提物還是醇提取物也表現(xiàn)出抗氧化作用。體外動物試驗發(fā)現(xiàn)，2%和5% HCT水提物能夠增強(qiáng)煎炸油喂養(yǎng)誘導(dǎo)SD大鼠的氧化應(yīng)激能力，提高血漿、肝臟總的抗氧化能力，肝臟低密度脂蛋白滯后時間延長[18]。在糖尿病大鼠試驗?zāi)Ｐ蜕贤瑯拥玫津炞C，2% HCT水提物降低糖尿病小鼠心臟和腎臟中ROS活性、TNF-α、IL-6水平，恢復(fù)心臟GSH含量[19]；HCT水提物（1和2 g/L）的預(yù)攝取可維持對乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝臟GSH含量，激活GSH-Px、CAT、SOD，減少氧化型谷胱甘肽（Glutathione Oxidized，GSSG）、MDA和ROS的形成[20]。細(xì)胞同樣證實(shí)HCT水提物抗氧化作用，與其他植物（鬼針草、枸杞、薄荷、車前、積雪草）水提物相比較，同一水提物濃度（25 μg/mL）下，HCT水提物處理H2O2誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞DNA彗星狀拖尾運(yùn)動現(xiàn)象百分比最低（11.14%），經(jīng)ABTS法測定，HCT甲醇提取物顯示出較高TEAC值（231.16 mmol/L），提示HCT提取物表現(xiàn)出較高的抗氧化能力，降低H2O2誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞DNA凋亡[21]。另外，HCT水提物（8 μmol/L）預(yù)處理，抑制β淀粉樣蛋白暴露大鼠初級皮層神經(jīng)元ROS及Ca2+水平，保護(hù)線粒體膜[22]。

2 HCT抗氧化應(yīng)激機(jī)制研究進(jìn)展

平衡狀態(tài)下的氧化應(yīng)激參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，過量氧化應(yīng)激產(chǎn)生自由基，攻擊組織細(xì)胞，引起細(xì)胞和組織內(nèi)的病理變化。機(jī)體通過氧化還原信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)過氧化水平，魚腥草作為植物抗生素，通過氧化應(yīng)激信號傳導(dǎo)通路調(diào)控，整合氧化還原途徑，維持機(jī)體氧化應(yīng)激平衡[7]。

2.1 PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激

動物試驗表明，芒果苷可激活胎盤中PI3K/Akt/mTOR通路，改善子癇前期小鼠胎盤氧化應(yīng)激[23]，磷脂酰肌醇3-激（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）阻滯劑LY29400能抑制姜黃素的抗氧化作用，恢復(fù)甘露醇誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS活性[24]。提示ROS通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗氧化作用。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平提高后，可引起PI3K/Akt信號通路的代償性激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)血紅素加氧酶（heine oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）的轉(zhuǎn)錄激活，起到抗氧化應(yīng)激的作用[25]。細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)，HCT水提物通過激活PI3K/Akt信號通路、抑制Toll樣受體4（Toll-like receptors4，TLR4）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），進(jìn)而保護(hù)丙泊酚誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷[26]。PI3K/Akt信號通路級聯(lián)叉頭框蛋白O（Forked（frame protein O，F(xiàn)oxO），F(xiàn)oxO激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactiva-tor-1α，PGC-1）PGC-1α與FoxO共同轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）、CAT的表達(dá)，增加抗氧化系統(tǒng)的功能[27]。體外試驗發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸處理引起人血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，而HCT水提液預(yù)處理通過增強(qiáng)FoxO1表達(dá)，激活PGC-1α調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體功能，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[28]。可以發(fā)現(xiàn)，HCT提取物通過PI3K/Akt信號通路級聯(lián)下游的FoxO1轉(zhuǎn)錄表達(dá)，激活PGC-1α，促進(jìn)抗氧化酶的生成，提高細(xì)胞抗氧化作用。

2.2 Nrf2/ARE信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激

Nrf2/ARE信號通路細(xì)胞抗過氧化的關(guān)鍵通路，正常情況下，Nrf2維持較低水平表達(dá)量。在氧化應(yīng)激源苯并（a）芘的刺激下，Nrf2、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，keap1）表達(dá)激活，RNA干擾發(fā)現(xiàn)抗氧化基因的表達(dá)與（Cu/Zn-SOD、CAT和GPx）基因的表達(dá)一致[29]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/keap1通路級聯(lián)核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidant response element，ARE），誘導(dǎo)抗氧化酶包括GSH、HO-1等表達(dá)增加[30]，提示Nrf2/keap1/ARE信號通路是誘導(dǎo)抗氧化基因所必需的。在動物試驗?zāi)Ｐ椭校琀O-1的表達(dá)水平升高，NF-κB的活化，降低下游炎癥因子的分泌，維持細(xì)胞正常氧化應(yīng)激水平[31]。體外細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)，HCT水提物抑制TNF-α誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞ROS的生成，并激活芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）和Nrf2，調(diào)節(jié)NADPH氧化酶（NADH oxidase，Nox），發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[32]。另有試驗證實(shí)，HCT抑制由苯并（a）芘誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞Nrf2、HO-1、醌氧化還原酶1（NADPH quinone dehydrogenase 1，NQO-1）蛋白表達(dá)下降，降低由苯并（a）芘誘導(dǎo)肺腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS活性[1]。可以看出，HCT及其提取物通過Nrf2的激活，促進(jìn)NQO-1、HO-1的表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)自由基的清除，發(fā)揮抗氧化作用。

2.3 TLRs信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激

在氧化應(yīng)激源刺激下，人單核細(xì)胞中TLR2/4 mRNA/蛋白表達(dá)水平升高，抗氧化劑羅布寧/N-乙酰半胱氨酸處理后，TLR2/4 mRNA/蛋白表達(dá)水平升下降，H2O2誘導(dǎo)促進(jìn)應(yīng)激源刺激下TLR2/4基因的表達(dá)[33]，TLRs偶聯(lián)下游炎癥因子（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、NF-κB，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷[34]，下調(diào)Bcl-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2），上調(diào)凋亡相關(guān)因子Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，BAX）、冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、caspase-9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]。細(xì)胞試驗證實(shí)，HCT提取物通過抑制TLR4/NF-κB通路，保護(hù)由丙泊酚誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷[26]。更為重要的是，HCT黃酮苷金絲桃苷、槲皮苷能有效抑制被H1N1病毒感染大鼠細(xì)胞內(nèi)TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制病毒復(fù)制[36]。動物試驗發(fā)現(xiàn)，HCT揮發(fā)油能通過抑制DOX誘導(dǎo)的慢性大鼠TLR4表達(dá)，降低氧化還原酶介導(dǎo)的NF-κB炎癥，抑制心肌細(xì)胞晚期凋亡[3]。在吸煙聯(lián)合氣管內(nèi)滴注脂多糖誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病大鼠模型上，低、中、高濃度HCT提取液下調(diào)caspase-3、caspase-9、TLR4、接頭蛋白髓樣分化因（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）和NF-κB（p65）的蛋白表達(dá)，提示HCT提取液通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB（p65）信號通路的激活，改善慢性阻塞肺疾病大鼠肺組織淤血、水腫、炎癥和凋亡[37]。更有研究證實(shí)，HCP通過TLR4、p-NF-κB（p65）的表達(dá)，抑制H1N1感染小鼠肺、腸炎癥[38]。另外動物試驗發(fā)現(xiàn)，HCT水提物通過抑制MAPK（p38）改善高脂血癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷[31]，細(xì)胞試驗同樣證實(shí)HCT水提物通過抑制MAPK（p38）降低脂多糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞的激活[39]。可以看出，HCT及其提取物能夠通過抑制TLRs/MyD88/NF-κB（p65）/MAPK（p38）通路的激活，可能通過下調(diào)caspase-3、caspase-9，保護(hù)氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)表明，HCT通過抑制p-p38-MAPK來抑制LPS誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

2.4 線粒體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激

內(nèi)源性ROS主要由線粒體呼吸鏈活動產(chǎn)生，線粒體功能受損，呼吸鏈電子傳遞的過程中出現(xiàn)電子漏出，與單分子氧進(jìn)行單電子還原生成超氧陰離子，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[40]。過量的氧化應(yīng)激線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放（mitochondrial permeability transition pore，MTPT），線粒體Ca2+外排，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potentia，MMP）改變，胞內(nèi)Ca2+濃度升高[41]。MTPT持續(xù)開導(dǎo)致線粒體膜去極化，細(xì)胞凋亡起始因子細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt-C）外泄，在胞質(zhì)內(nèi)激活caspase-9、caspase-3，與過氧化應(yīng)激反應(yīng)所激活的Bcl-2/Bax一起共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡[42]。另外，去極化的線粒體膜電位后，PTEN誘導(dǎo)推定激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）募集并活化帕金基因表達(dá)引起線粒體自噬[43]。動物試驗和細(xì)胞試驗都表明，HCT及其提取物能夠通過多種途徑，調(diào)節(jié)線粒體依賴的氧化應(yīng)激，在D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型上，HCT 甲醇提取物中分離的黃酮醇糖苷，可通過Rev-Erb-α/磷酸-AMPK/SIRT1信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)線粒體自噬，增強(qiáng)線粒體生物合成，降低線粒體自噬相關(guān)蛋白 PINK1和帕金基因表達(dá)的增加[44]。同時，HCT水提物通過穩(wěn)定線粒體膜電位水平，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，抑制caspase-3激活，保護(hù)由β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)大鼠原代皮層神經(jīng)元[28]。由此可以看出，HCT及其提取物通過降低胞內(nèi)Ca2+，恢復(fù)MMP水平，穩(wěn)定線粒體功能，減輕過度氧化應(yīng)激。另外，HCT及其提取物通過增加Bax/Bcl-2比值，抑制caspase-9、caspase-3，降低線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、帕金表達(dá)，減輕因過度氧化應(yīng)激而造成的細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)語

體內(nèi)外試驗表明：HCT及其提取物通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，清除自由基，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用，HCT作為一種天然抗氧化物，通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路、Nrf2/ARE信號通路、TLRs信號通路及線粒體介導(dǎo)的信號通路，發(fā)揮抗氧化作用（圖1）。HCT及其提取物通過PI3K/Akt信號通路，級聯(lián)下游FoxO1激活PGC-1α，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激模型中PI3K/Akt信號通路激活，可調(diào)節(jié)Nrf2、HO-1轉(zhuǎn)錄[25]，可以得到啟示HCT提取物通過PI3K/Akt/FoxO/PGC-1α通路提高細(xì)胞抗氧化能力的同時，也激活Nrf2/HO-1通路啟動抗氧化應(yīng)激。近期的細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)，HCT提取物激活PI3K/Akt信號通路、抑制TLR4/NF-κB，調(diào)控Nrf2/HO-1發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[25]，提示HCT提取物可能通過PI3K/Akt信號通路的激活、TLR4/NF-κB的抑制，促進(jìn)Nrf2/HO-1的抗氧化作用。而近期的試驗證實(shí)HCT提取物去甲頭花千金藤二酮B，通過激活PI3K/Akt、提高HO-1，幫助海馬神經(jīng)元細(xì)胞抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[45]。除此之外，HCT提取物抑制TLR4/MyD88/NF-κB（p65）通路[38]，抑制MAPK（p38）[28-39]、下調(diào)caspase-3、caspase-9，防止細(xì)胞過氧化凋亡[38]，而HCT及其提取物在線粒體途徑依賴氧化應(yīng)激通路中，HCT能增加Bax/Bcl-2比率，抑制caspase-9、caspase-3激活[45]，防止細(xì)胞凋亡，提示HCT提取物可能通過TLR4/MyD88/NF-κB，同時抑制線粒體、胞漿凋亡蛋白的激活，共同抵御氧化應(yīng)激損傷。

圖1 HCT及其提取物抗氧化應(yīng)激機(jī)制

HCT及其提取物抗氧化應(yīng)激機(jī)制涉及多個信號通路、多個信號因子，各個信號通路、信號分子之間相互作用，氧化應(yīng)激反應(yīng)。未來可從多種途徑、多種分子水平系統(tǒng)性地研究魚腥草抗氧化應(yīng)激機(jī)制，以及魚腥草抗氧化應(yīng)激不同信號通路，從而豐富魚腥草抗氧化應(yīng)激的理論研究內(nèi)容和提供實(shí)踐應(yīng)用指導(dǎo)。