干酪中生物活性化合物的產生及生理功能的研究進展

司闊林，閆清泉，吳政，李玲玉，趙中華，宗學醒

內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司（呼和浩特 011500）

干酪（cheese）種類眾多、用途廣泛且高營養健康，通常是由牛乳經凝乳酶凝乳排乳清制得新鮮或發酵成熟的乳制品。干酪在成熟過程中會涉及一系列復雜的生物化學反應從而產生或釋放多種生物活性成分——肽、胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、脂肪酸、有機酸、維生素、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和共軛亞油酸（CLA）。體內和體外研究表明，這些化合物具有多種重要的健康益處，包括抗氧化、抗增殖、抗炎、免疫調節和抗菌活性等生理功能[1]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）通過代謝牛乳蛋白質增強干酪功能及最終產品的質地和風味的形成外，在生物活性化合物的產生過程中也發揮主要作用[2]。因此，詳細概述影響干酪生物活性成分產生的影響因素，并對不同類型干酪中的生物活性成分及生理功能進行介紹。

1 干酪生物活性成分產生的影響因素

1.1 干酪加工技術對生物活性成分產生的影響

干酪的制作是一個復雜的動態變化過程，一些工藝程序如熱處理方式、均質、加壓和牛乳凝固方式等都可能會影響牛乳成分的結構，從而影響生物活性化合物的產生和釋放[3-4]。

研究表明，熱處理會改變牛乳及干酪成分（如蛋白質含量），從而影響干酪的質量[5-6]，然而Hilario等[7]研究表明，熱處理不會影響干酪的蛋白質含量和脂肪酸分布。Albenzio等[5]分別用生牛乳和巴氏殺菌牛乳（在80 ℃熱乳清中熱處理凝乳30 s）制成干酪，結果表明，熱處理牛乳制成的干酪的水溶性氮含量和總氮含量比生牛乳制成的干酪要高。Lee等[8]對牛乳分別進行不同的加熱方式（65 ℃，30 min、65 ℃，15 s和72 ℃，15 s）后制作成Cheddar干酪，結果表明，72 ℃，15 s熱處理的牛乳制作的干酪中微生物多樣性最低，而65 ℃，15 s熱處理的牛乳制作的干酪具有最高的蛋白水解和脂解活性，由此基本上能夠得出熱處理條件會影響生物活性肽的數量和特定序列。

干酪蛋白質的變化通常與它們的功能特性有關，并受牛乳特有酶作用的影響。牛乳中的蛋白酶和肽酶（主要為纖溶酶）水解蛋白質生成大肽和中肽，這些肽再在凝乳酶的作用下進一步水解，在發酵劑和非附屬發酵劑的作用下形成短肽或游離氨基酸（圖1）[6]。牛乳中的纖溶酶耐熱性較強，在加熱過程中天然纖溶酶抑制劑的失活及牛乳中的纖溶酶原被激活導致其活性增加，因此，干酪生產過程中對牛乳巴氏殺菌或熱處理有利于肽的形成[9]。Moatsou等[10]研究也發現，在干酪制作過程中，纖溶酶活性也與溫度和壓力等加工條件有直接相關性。相比于纖溶酶，牛乳中的另外一種蛋白質水解酶組織蛋白酶D在巴氏殺菌和乳清排出后活性受到明顯抑制[6]。

圖1 干酪成熟過程中蛋白質分解和氨基酸分解代謝概述

此外，Paul等[11]通過氧自由基吸收能力（ORAC）方法評估發現，在新鮮干酪包裝過程中高壓和高溫會影響含有生物活性肽的水溶性蛋白質的抗氧化活性。另一項研究表明，對Garrotxa干酪施加高靜水壓力（400 MPa，5 min，14 ℃）會影響脂肪分解且游離脂肪酸含量較低，這可能是由于微生物的減少或次級微生物群的脂解酶失活[12]。

1.2 成熟條件和乳酸菌對生物活性成分產生的影響

干酪成熟時期產生的生物活性短肽的含量會受到多種因素的影響，其中成熟時間和溫度可影響干酪中菌株的活性及酶的活力，從而影響干酪蛋白質的水解和生物活性肽的產生。馬玲等[13]測量不同成熟時期Mozzarella干酪的不同抗氧化指標，結果表明成熟40 d的Mozzarella干酪的DPPH自由基清除率最高達到67.76%，成熟50 d的Mozzarella干酪的還原力最強，達到1.23，同時通過小鼠試驗驗證提取液具有一定抗氧化性。Ong等[14]發現4 ℃和8 ℃的成熟條件對Cheddar干酪的血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽不存在顯著的影響（P＜0.05），但ACE抑制肽一般都是在成熟初期積累，隨著成熟時間的延長及蛋白質水解的進行，部分肽會被水解成小肽。Rizzello等[15]通過對不同成熟期的各類干酪生物活性進行對比發現，未經成熟的新鮮模擬干酪的水溶性提取物（WSE）具有較強的抑菌活性，而成熟期較長的兩種意大利干酪的提取物則不具有抑制致病菌生長的功能。

干酪內微生物是一個動態、多菌相的系統，特點是乳酸菌、酵母和霉菌共存，但都會存在著優勢菌群，在干酪感官特性的形成和干酪生產的技術方面發揮重要作用。在制作干酪過程中，乳酸菌一方面作為發酵劑（starer lactic acid bacteria，SLAB）添加，其蛋白水解系統能夠在干酪成熟過程中有序協調地參與酪蛋白的降解作用，另一方面為牛乳中自然存在的非發酵劑乳酸菌（non-starer lactic acid bacteria，NSLAB，主要為乳桿菌），非發酵劑乳酸菌在干酪成熟的前幾周低速生長，最終在發酵劑乳酸菌死亡階段后成為干酪內的優勢菌群。這2組不同來源的乳酸菌在干酪成熟過程中代謝釋放出生物活性肽、EPS、維生素、CLA、GABA和低聚糖等生物活性成分（圖2）[16]。

圖2 乳酸菌在干酪成熟過程中所釋放的生物活性成分及過程

2 不同干酪中生物活性成分及其生理功能

2.1 生物活性肽

生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的特定蛋白質片段，又稱功能肽，在細胞生理及代謝功能的調節上具有重要作用，如神經系統、消化系統、循環系統、內分泌系統等。生物活性肽的功能取決于肽的蛋白質和氨基酸序列的特定水解，這導致不同生物活性特性的表達（表1）。

表1 不同類型干酪在發酵和成熟過程中產生的生物活性肽

干酪中的主要生物活性肽包括三肽異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（IPP）和纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸（VPP），具有ACE抑制活性，ACE抑制肽在人體中激肽釋放酶-激肽系統和腎素-血管緊張素系統，在血壓調節方面是一對相互拮抗的體系，其平衡協調對維持正常血壓有重要作用[24]。Bütikofer等[25]通過質譜聯用方法對44種傳統軟干酪、半硬質干酪和硬質干酪中的IPP和VPP進行定量分析發現，IPP和VPP的最大濃度分別為95和224 mg/kg，并測定其ACE活性，IC50值介于2.0～29.5 mg/mL。有研究證明[26]，長成熟期的Cheddar干酪為ACE抑制肽的重要來源，除VPP和IPP外，還包括EKDERF、VRYL、YPFPGPIPN、FFVAP，且隨著成熟時間的延長，威斯康星州Cheddar干酪中的ACE抑制肽類型和濃度增加，IPP、VPP和EKDERF的最大值分別為2.8，7.4和5.3 mg/100 g；然而，與成熟時間較短的（3-6 d）干酪相比，Cheddar干酪的水溶性提取物部分的ACE活性隨著成熟時間的增加而下降（長達2個月），隨后ACE活性穩定或增加，這表明成熟過程對干酪生物活性肽抗高血壓的重要性。值得注意的是，干酪經胃腸道消化后其肽譜會發生變化，從而可能導致這些肽的生物活性程度也發生變化，如Gamalost干酪和Norvegia干酪的ACE活性在胃腸道消化過程中會有所提高[27]。

抗氧化肽能夠清除自由基從而防止脂質過氧化的發生，與合成抗氧化劑相比，抗氧化肽無副作用，易消化吸收，營養和加工特性良好。隨著乳制品加工技術的發展和研究的深入，國內外學者逐漸認識到乳蛋白的水解產物具有優良的抗氧化性。Higurashi等[28]從Gouda干酪中分離得到抗氧化肽，結構為HPIL和HGGLPG，這2種肽段的分子量均小于3 kDa，且具有較高DPPH自由基清除能力，是市售化學抗氧化劑的2倍。Timon等[29]使用不同來源的凝乳酶生產的硬質干酪富含抗氧化肽、EIVPN、DKIHPF和VAPFPQ，具有高金屬螯合活性。相關研究表明，抗氧化肽的抗氧化活性與其氨基酸組成有關系，當肽中含有疏水性和酸性氨基酸，極易與疏水性多不飽和脂肪酸結合，抑制脂質氧化，從而增加抗氧化肽的抗氧化活性。

除ACE抑制肽和抗氧化肽外，干酪中還有免疫調節肽、抗菌肽、阿片活性肽、抗腫瘤肽等生物活性肽。研究學者從酪蛋白的水解產物中分離出抗菌肽，同酪蛋白結構進行比對，發現主要源自αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，同時這些肽對多種革蘭陰性、陽性細菌都具有抑制作用，可以調節腸道內的微生物菌群[22]。Pritchard等[30]對3種不同的澳大利亞Cheddar干酪的水溶性提取物的抑菌性進行了研究，結果發現分子量大于10 kDa的肽可明顯地抑制大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌的生長。Yasuda等[31]研究12種市售長成熟期干酪對白血病細胞株HL-60生長與其DNA片段誘導的影響，發現多種干酪可以明顯抑制癌細胞增長，誘導細胞DNA斷裂，并從相應的干酪中分離得到抗腫瘤肽。

2.2 微生物EPS

EPS是由發酵劑和附屬發酵劑在食品發酵過程中產生的具有生物活性的碳水化合物大分子，發酵乳制品（如酸奶、干酪和酪乳）主要在乳酸菌的作用下中產生EPS。EPS聚合物以長鏈形式存在，該長鏈由支鏈取代的糖衍生物、重復的糖單元或取代的糖組成，包括磷酸或乙酰基取代基。EPS具有降膽固醇、降血糖和抗氧化等多種重要的益生功能。越來越多的研究將能夠代謝EPS的乳酸菌應用到干酪制作中，Nepomuceno等[32]將Lactococcus lactisssp. cremoris，Lactococcus lactisssp. lactis和Streptococcus thermophilus作為發酵劑添加到Prato干酪中，結果發現干酪在成熟期間會代謝產生EPS且其感官特征和生理特性不受影響。同時有研究表明，干酪中的EPS含量除受菌種種類影響外，還與水分和脂肪轉化有關，且干酪中含有EPS不僅能夠改善生理健康，還可以提高干酪產量，如使用Streptococcus thermophilusST446、Lactobacillus rhamnosusLRA和Lactobacillus plantarumLP作為附屬發酵劑生產低脂Caciotta干酪，其保濕性、產量和游離氨基酸含量都顯著提高[33]。然而富含EPS的干酪還需要通過動物研究和臨床試驗進一步研究和驗證其特定的健康益處。

2.3 γ-氨基丁酸（GABA）

GABA是一種非蛋白質氨基酸，是植物和微生物通過谷氨酸脫羧產生的代謝產物，作為哺乳動物大腦中的主要抑制性神經遞質，具有降血壓、抗癲癇、抗抑郁等多種重要的生理功能。據報道，乳桿菌屬和乳球菌屬的細菌從發酵食品中產GABA，其中從干酪中已分離出產GABA的Lactobacillus delbrueckiissp. bulgaricus、Lactobacillus plantarum和Lactobacillus paracasei[34]。Diana等[35]采用高效液相色譜法測定34種西班牙手工干酪中的GABA含量，結果表明，GABA濃度高達330 mg/kg且不受成熟期或奶源的影響。由于谷氨酸通過酪蛋白水解、低pH環境及厭氧作用合成GABA，因此適當的成熟條件可以促進干酪中GABA含量增加，尤其是乳酸菌發酵劑種類的選擇，Lacroix等[36]研究發現，乳酸菌發酵劑ULAAC-A和ULAAC-H在加拿大干酪中能產生大量GABA，且對來自9種法國的商用干酪進行檢測，結果發現其中4種干酪中檢測到GABA，且成熟期較長的Danish Havarti干酪GABA含量最高為324 mg/100 g，這表明長時間的成熟過程導致更高濃度的游離氨基酸和谷氨酸；而Gouda干酪GABA含量僅129 mg/100 g，但是其谷氨酸含量最低，這表明其已基本轉化為GABA。

2.4 共軛亞油酸（CLA）

干酪中的脂肪含量為20%～35%，而在脂肪含量中，約66%為飽和脂肪酸（SFA），30%為單不飽和脂肪酸（MUFA），4%為多不飽和脂肪酸（PUFA）。脂肪酸參與各種生物過程，充當能量底物和調節細胞，并影響基因表達、PUFA生物利用度和脂肪沉積。在自然界中的共軛脂肪酸中，CLA異構體被認為是功能性脂質分子，是具有共軛雙鍵的亞油酸（C18∶2）的一組異構體，主要異構體為c9、t11-CLA、t10和c12-CLA，其中c9，t11-CLA具極強免疫調節活性，如抗氧化、抗高血壓、抗癌、抗脂肪、抗炎、抗糖尿病和抗肥胖等生理特性[1]。CLA異構體天然存在于牛乳中，干酪中CLA含量占總脂肪酸的0.05%～2.86%，乳酸菌主要利用水合酶、脫氫酶、異構酶和還原酶對脂肪酸生物氫化，從而合成CLA，因此干酪中CLA的合成及含量取決于發酵時間、原料乳中CLA的組成以及乳酸菌的亞油酸異構酶活性。有大量研究生產出具有高含量CLA的干酪：Ares-Yebra等[37]從生牛乳中分離出的產CLA的Lactobacillus plantarumL200被用于生產微型干酪，制備的干酪中含有高含量的c9和t11-CLA；Gursoy等[38]使用Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus paracasei和Bifidobacterium longum后，干酪中CLA的含量分別增加16.25%，7.64%和20.44%，因此從未開發的干酪產品中尋找具有適當組合的潛在菌株，很大程度能找到生產富含CLA干酪產品的有效菌株。此外，植烷酸（C20）也是干酪中另一種重要的脂肪酸，被4個甲基分鏈飽和，具有增強肝細胞攝取葡萄糖的能力，能夠改善葡萄糖穩態，并防止MetS和2型糖尿病發生。

2.5 有機酸

干酪中乳酸菌的自溶使參與干酪成熟的細胞內酶更容易到達其底物，釋放出抗菌物質，如有機酸、二乙酰、乙偶姻、過氧化氫和細菌素等，其中Cheddar干酪中的蘋果酸及Ossalano干酪中的檸檬酸、乳清酸、丙酮酸、乳酸、尿酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和馬尿酸等有機酸均已被檢測到[39]。這些有機酸有助于干酪風味的形成及品質的提升，如Swiss干酪中的丙酸桿菌代謝乳酸生產丙酸，是其風味形成的關鍵。根據微生物的生理狀態和外部環境的物理化學特征，有機酸可作為具有抑菌和殺菌活性的抗菌劑，從而提高干酪的衛生質量，因此定量測定干酪中的有機酸對于監測細菌生長和感官質量非常重要。

2.6 維生素和礦物質

牛乳中的大部分脂溶性維生素都保留在干酪中，然而由于乳清的排出，干酪中水溶性維生素的濃度通常低于牛乳中的濃度。干酪中的維生素主要有核黃素、維生素B12、煙酸、葉酸和維生素A，具有多種生物學功能，如刺激免疫系統、調節基因表達和維持弱視視力等。值得注意的是，干酪成熟過程中微生物合成維生素能夠很大程度地抵消B族維生素的損失，如Emmental干酪中的丙酸菌能夠合成大量維生素B12，且50 g Cheddar干酪可分別為男性和女性提供28%和32%的建議每日維生素A攝入量[40]。

干酪也是幾種礦物質的重要來源，尤其是鈣、鋅、磷和鎂。干酪中的鈣和磷含量遠高于牛乳：軟干酪中的鈣和磷含量是牛乳的4～5倍，半硬質干酪中的鈣和磷含量是牛乳的7到8倍，硬質干酪中的鈣和磷含量達10倍，且50 g硬質干酪可提供約400 mg鈣，涵蓋1～10歲兒童每日推薦鈣攝入量的100%。此外，鈣磷比有著特殊的生理功能，它以一種高度生物可利用的形式被消化，由于鈣和干酪中的酪蛋白肽之間形成復合物，保持鈣的可溶形式，并保護鈣不在腸內沉淀從而促進鈣的吸收。干酪是生物可利用鈣的優秀來源，且膳食鈣和維生素D在與低熱量飲食相結合時，有可能預防骨質疏松癥并有助于減肥，此外膳食已證明，鈣通過抑制脂肪和膽汁酸的吸收、增加糞便脂肪的排泄以及誘導膽固醇轉化為膽汁，具有降血脂機制。

3 結語

干酪種類眾多且風味獨特，是世界上最受歡迎的發酵乳制品之一。盡管近年來干酪因脂肪和鈉含量而有一些負面影響，但其仍然具有多種生物活性成分且已被證明對機體有著非常重要的生理功能特性，如已報道，攝入干酪具有降血壓和降低心血管危險因素（肥胖、血脂異常和2型糖尿病）的潛力，干酪中的成分是釋放生物活性化合物的良好前體，乳酸菌在成熟過程中有著主導作用。干酪中的生物活性化合物主要為乳酸菌水解蛋白質而成的生物活性肽。GABA和CLA也是重要的代謝產物，具有預防疾病的巨大潛力。此外其他重要的化合物，如EPS可以增強干酪的流變特性，具有抗氧化、抗菌和免疫特性。評估食品成分的生物活性時，需考慮多方面，因此仍需更多的體外和體內研究來證明食用新鮮和成熟干酪所帶來的健康益處和生物活性效應。