響應面優化水酶法提取油茶籽油工藝

林莉，董瑋，周敏，楊衛林，龍開偉，陳順利

1. 凱里學院大健康學院（凱里 556001）；2. 凱里學院理學院（凱里 556001）；3. 貴州綠色農業開發有限公司（錦屏 556704）

油茶籽（Camellia oleiferaseed）也稱山茶籽，是我國四大木本油料之一[1]。油茶籽油具有降血壓血脂、軟化血管等保健作用，是我國理想的“健康型”食用油[2-3]。油茶籽油還可作為高級天然化妝品用油原材料[4]。此外，油茶籽油中微量營養素（維生素E、植物甾醇、角鯊烯等）含量較高，有預防高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等作用[5]。隨著我國耕地面積少，油茶作為我國的木本科油料作物，大規模種植可以改善生態環境，增加收入，對油茶產業的發展具有很大潛力[6]。

油茶籽油的提取方法多樣，通過壓榨法所得到的油脂風味好，但存在油脂品質不高、得油率偏低等問題。浸出法存在工序復雜，提取成本較高，在堿煉、脫臭、脫色過程中有機物會損失，制得油茶籽油風味較差，存在溶劑殘留等問題[7-8]。水酶法提油與其他提油方法相比，主要是以水為溶劑，利用酶制劑的活性，通過酶與底物反應，從而使油脂分離出來。水酶法提取油脂具有安全性高[9-11]、工藝條件較溫和、設備簡單、油品質較高、耗能少、對環境污染小、資源利用率高等特點[12-15]。近年來，水酶法提油已有推廣，采取水酶法提油的方法，不但能提高提油效率，也能防止致癌物的形成，從而更好地保留茶多酚、維生素等多種成分[16-17]。試驗選擇水酶法提取油茶籽油，為進一步提高油茶籽油的綜合利用提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

油茶籽（貴州省綠色農業開發有限公司）。

果膠酶（酶活力60 000 U/g，河南林博生物有限公司）；纖維素酶（100 000 U/g，東勝生物有限公司）；中性蛋白酶（100 000 U/g，和氏壁生物科技有限公司）；所用其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

1002型電子天平（杭州萬特衡器有限公司）；800C型高速粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）；AXTD5A型離心機（鹽城市安信試驗有限公司）；HH-2A型水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；101-3ASB型電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 操作流程

油茶籽原料預處理：干燥后的油茶籽脫殼，將殼與仁分開，油茶籽果仁采用粉碎機粉碎后過0.250 mm（60目）孔徑篩，得到油茶籽粉，備用。

水酶法提油工藝流程：稱取5 g過0.250 mm（60目）孔徑篩后的油茶籽粉，按一定料液比加水煮沸1 h，冷卻后調節至所用酶制劑的適用作用pH，加入一定量酶制劑在適宜溫度下酶解，待酶解結束后按4 000 r/min離心30 min，取上層清油旋轉蒸發得到油茶籽油。

1.3.2 油茶籽油提取率計算[18]

式中：Y為油茶籽油提取率，%；m1為提取所得油茶籽油質量，g；m2為油茶籽的脂肪含量，g；m3為試驗稱取的油茶籽粉質量，g。

參照GB/T 5512—2008《糧油檢驗：糧食中粗脂肪含量測定》，經測定試驗所用油茶籽仁中含有36.30%的油脂，因此試驗以原料中油脂含量36.30%計算提取率。

1.3.3 酶制劑的篩選

選擇果膠酶（最適作用pH 3.5、作用溫度50 ℃）、纖維素酶（最適作用pH 4.8、作用溫度60 ℃）、中性蛋白酶（最適作用pH 6.0、作用溫度50 ℃）作為酶制劑，分別按1.3.1小節中水酶法提油工藝流程進行操作，篩出油茶籽油提取率高的酶制劑。

1.3.4 單因素試驗

準確稱取5 g油茶籽粉末，通過單因素試驗考察四因素對油茶籽油提取率的影響，具體方案見表1。

表1 單因素試驗因素與水平

1.3.5 響應面試驗

采用響應面法優化單因素試驗，設計四因素三水平試驗進行優化，因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平

1.3.6 數據處理

試驗數據采用Excel與Design Expert 8.06軟件進行統計分析，采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 酶種類對油茶籽油提取率的影響

由圖1可知，在選擇不同酶制劑提取油茶籽油時，果膠酶比纖維素酶、中性蛋白酶對油茶籽油的提取率影響大。果膠是一種多糖，主要存在于植物細胞壁和細胞內層，而油茶籽中含有20%～30%的茶籽多糖[19]。果膠酶能使油茶籽細胞壁和細胞內層的果膠大分子有效降解，油茶籽細胞破裂油脂被釋放出來。因此，試驗確定果膠酶作為油茶籽油提取工藝的酶制劑。

圖1 酶種類對油茶籽油提取率的影響

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解溫度對油茶籽油提取率的影響

每種酶都有其最適反應溫度，當反應體系溫度低于酶的最適反應溫度時，隨著溫度的升高，反應物的能量增加，分子間的接觸次數單位時間內增加，加快反應速度。反應體系溫度高于酶的最適溫度時，能量被酶分子過多吸收，酶蛋白發生變性，其活性減弱甚至喪失催化活性[20]。由圖2可以看出，酶解溫度在45～50 ℃之間時，油茶籽油提取率上升，但在50 ℃后，提取率開始平緩下降。因此可以得到，在提取油茶籽油過程中最適酶解溫度為50 ℃。

圖2 酶解溫度對油茶籽油提取率的影響

2.2.2 酶解時間對油茶籽油提取率的影響

由圖3可以看出，在1～4 h之內，酶解時間與油茶籽油提取率呈正相關，在酶解4 h時，提取率達到峰值。隨著酶解時間的延長，提取率呈現下降趨勢。這是由于酶解時間延長體系中的蛋白質、纖維素等成分會和油脂相結合[21]，導致提取率降低，且酶解時間過長也會影響油的品質。因此選擇酶解時間4 h較合適。

圖3 酶解時間對油茶籽油提取率的影響

2.2.3 酶用量對油茶籽油提取率的影響

由圖4可知，酶用量0.5%～1.5%時，油茶籽油提取率隨酶用量的增加而增加，酶用量1.5%時提取率最大。但在酶用量達到1.5%后，提取率隨酶用量的增加而降低。這可能是由于在底物濃度固定的條件下，酶的加入量在一定范圍內與酶解效率呈正比關系，當酶用量高于一定量時，酶解效率略有降低并趨于平緩。綜合考慮，選擇果膠酶用量1.5%較好。

圖4 酶用量對油茶籽油提取率的影響

2.2.4 料液比對油茶籽油提取率的影響

由圖5可見，料液比1∶3～1∶5 g/mL時，油茶籽油提取率與液體占比呈正比，這可能是由于油茶籽中含有一定量的淀粉和蛋白質，具有較強的吸水膨脹能力，液體占比較小時物料變得黏稠，流動性差，不易攪拌，故增加液體占比提取率也增大[22-23]。料液比1∶5 g/mL時對油茶籽油提取率影響最大，但在料液比1∶5 g/mL之后，油茶籽油提取率呈下降趨勢，這可能是由于液體占比的增加稀釋了酶與底物的濃度，使酶的作用效果受到影響。因此，該試驗選擇料液比1∶5 g/mL較好。

圖5 料液比對油茶籽油提取率的影響

2.3 響應面試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗結果

在單因素試驗基礎上，以油茶籽油提取率作為試驗指標，酶解時間（A）、料液比（B）、酶用量（C）和酶解溫度（D）4個因素作為自變量，采用Box- Behnken模型對提油工藝進行優化，結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

對表3中的試驗數據結果進行多次擬合回歸分析，得到模型的二次多項回歸方程：Y=84.10+0.54A+ 0.37B+0.80C+0.10D-0.52AB+0.15AC+1AD-0.10BC+ 0.25BD+0.25CD-2.60A2-2.65B2-2.81C2-2.36D2。各項系數的絕對值的大小表示各影響因素對油茶籽油提取率的影響大小。由此可知，各因素對油茶籽油提取率的影響大小順序為酶用量（C）＞酶解時間（A）＞料液比（B）＞酶解溫度（D）。對該模型方差分析，結果見表4。

由方差分析表4可得，失擬項不顯著（P＞0.05），回歸模型極顯著（P＜0.000 1），證明該模型擬合程度好。由表4可知，可調整確定系數Radj2為0.955 9，方程的決定系數R2為0.978 0，說明試驗數據有較高的可信度，具有統計學意義。由P值可知，酶用量對油茶籽油提取率的影響極顯著（P＜0.01），酶解時間和料液比影響顯著（P＜0.05），酶解溫度影響不顯著（P＞0.05），二次項A2、B2、C2、D2對模型影響極顯著。

表4 回歸模型方差分析

2.3.2 響應面各因素間交互作用分析

如圖6～圖11所示：在因素間交互作用對提取率的影響中，圖6、圖9、圖10和圖11中響應曲面雖陡峭，但交互作用的等高線圖呈現圓形，說明交互作用不顯著。由圖7可知：酶解時間保持不變時，油茶籽油提取率隨著液體占比的增大呈現先增后減趨勢，料液比保持不變時，提取率呈現相同趨勢；響應曲面陡，等高線接近橢圓形，故酶解時間與料液比兩因素間交互作用顯著。由圖8可知：當酶解時間保持不變時，提取率隨著酶解溫度的增大呈現先升后降趨勢，酶解溫度保持不變時，提取率也隨酶解時間增加呈現先升后降趨勢；響應面曲面較陡，等高線呈現橢圓，故酶解時間與酶解溫度兩因素間交互作用極顯著。

圖6 酶解時間與酶用量對油茶籽油提取率影響的響應面圖及等高線

圖7 酶解時間與料液比對油茶籽油提取率影響的響應面圖及等高線

圖8 酶解時間與酶解溫度對油茶籽油提取率影響的響應面圖及等高線

圖9 料液比與酶用量對油茶籽油提取率影響的響應面圖及等高線

圖10 料液比與酶解溫度對油茶籽油提取率影響的響應面圖及等高線

圖11 酶用量與酶解溫度對油茶籽油提取率影響的響應面圖及等高線

2.3.3 最佳提取條件的預測和驗證

使用Design-Expert分析得出最佳提取方案：酶用量1.64%、酶解溫度50.27 ℃、料液比1∶5.06 g/mL、酶解時間4.10 h。為方便操作，將最佳方案調整為酶用量1.6%、酶解溫度50 ℃、料液比1∶5 g/mL、酶解時間4 h。經過3次驗證后，平均提取率為84.03%，與預測值84.20%無較大差異，由此可知，該模型擬合效果較好，表明最佳方案可靠。

3 結論

試驗確定果膠酶為提取油茶籽油最佳酶制劑。通過響應面試驗分析，得到最佳方案：酶用量1.6%、酶解溫度50 ℃、料液比1∶5 g/mL、酶解時間4 h。經3次驗證，最高提取率為84.03%。上述因素對油茶籽油提取率影響順序為酶用量＞酶解時間＞料液比＞酶解溫度。

試驗所得油茶籽油可進一步測定其脂肪酸組成，酸值、過氧化值等理化指標，與壓榨所得的油茶籽油進行對比分析，為油茶籽油提取方法的多樣性提供理論依據。同時，探索油茶籽油與其他油脂進行調和，研究其脂肪酸組成及風味成分，可更好地確定油茶籽油的運用方向。