冬小包腳菇菌基土壤微生物群落多樣性與土壤理化性質相關性研究

李鵬，熊雪，向準，和耀威，黃靜，王晶，劉忠玄

(貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009)

冬小包腳菇(Volvariella brumalisHe sp.)俗稱低溫草菇、谷樁菌，隸屬于光柄菇科(Pluteaceae)包腳菇屬(Volvariella)，是何紹昌先生在1987年發現的新種[1]，全國僅貴州有分布，也是包腳菇屬中唯一一個低溫出菇種類，出菇溫度4～17℃[2，3]，填補了該屬可食用種類均為中高溫型的缺陷，對彌補草菇冬季市場缺口具有重要意義。該菇肉質鮮美可口，含有豐富的氨基酸和礦物元素，具有重要的市場價值和科研價值[4，5]。由于其野生資源較少、分離及培養難度大、馴化產量不穩定等原因，目前僅在野外生境、形態特征、仿生栽培等方面有研究[2，6]，在高效栽培、耐低溫機制等方面仍處于空白。

土壤微生物群落是土壤生態系統預警和敏感性的重要指標之一[7]，其對食用菌菌塘的形成、養分調節和生態系統物質循環和能量流動具有重要意義[8]。研究表明，土壤微生物對食用菌菌絲體的生長、菌核的形成、子實體的發生均起著關鍵作用[9，10]。近年來，有關食用菌土壤微生物研究較少，主要集中在物種組成、結實相關性、連作障礙等方面，尚未見不同生長發育時期菌基土壤微生物研究的相關報道。因此，本試驗以貴州特有的野生冬小包腳菇菌基土壤為材料，研究其微生物群落結構與組成、土壤理化性質，旨在了解冬小包腳菇不同生長發育時期土壤微生物群落組成和結構、理化性質，以期為冬小包腳菇人工馴化栽培、穩產高產及功能微生物菌群的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 子實體的采集和培養基 供試菌株:野外采集的冬小包腳菇子實體，經組織分離培養后得到，現保藏于貴州省生物研究所。

分離培養基:馬鈴薯(去皮)200 g，稻草40 g(剪成2～3 cm段，沸水30 min)，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

1.1.2 土壤樣品采集 冬小包腳菇菌基土壤于2020年12月底采集自貴州省遵義市匯川區板橋鎮三衙莊、大溝村(海拔879～1 000 m，溫度6.5℃)。野生冬小包腳菇主要生長在種植水稻后輪作種植小麥、油菜的農田。戴無菌手套和口罩，選擇蛋形期(E1)、伸長期(L2)、成熟期(M3)和自溶期(A4)的冬小包腳菇各3株(圖1)，小心挖取子實體及菌托土壤，用無菌鑷子刮取冬小包腳菇菌托表面的土壤后，置于滅菌離心管中，放入車載冰箱-20℃保存備用，共采集樣品12個。去除土壤表面的雜草等雜物后，取子實體周邊半徑10 cm、深度0～10 cm的土壤，每個子實體采集1份，共12份，裝入自封袋，用于土壤理化指標分析。

圖1 野生冬小包腳菇不同生長發育期

1.2 試驗方法

1.2.1 冬小包腳菇菌株的分離與鑒定 采用組織分離法對冬小包腳菇子實體進行分離，置于18℃培養箱中培養，將培養得到的菌絲體進一步純化后進行分子鑒定。采用生工生物工程(上海)股份有限公司生產的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取真菌基因組DNA，并用真菌通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增，PCR反應體系(25 μL):基因組DNA(20～50 ng/μL)0.5 μL，10×buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1 μL，Taq酶0.2 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加去離子水至25 μL。反應程序:94℃預變性4 min；94℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃再延伸5 min，4℃終止反應保存。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.2 土壤理化指標測定 土壤理化指標由貴州省農業科學院農業資源與環境檢測中心進行測定。土壤全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質含量和pH值分別依據NY/T 53—1987、NY/T 88—1988、NY/T 87—1988、LY/T 1228—2015、NY/T 1121.7—2014、NY/T 889—2004、NY/T 1121.6—2006、NY/T 1377—2007測定。

1.2.3 土壤樣品DNA提取和PCR擴增 采用Soil Genomic DNA Kit試劑盒提取菌基土壤DNA，用超微量分光光度計檢測所提取DNA的濃度和質量。利用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌16S rDNA的V3～V4可變區，引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增真菌ITS區域，PCR擴增體系和程序同1.2.1，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

1.2.4 數據分析 利用FLASH和fastp軟件，根據PE reads之間的overlap關系，對各樣本數據進行優化和質控過濾，得到有效數據。按照97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析，將OTU與NCBI數據庫比對并對OTU進行物種注釋。利用交互式微生物多樣性云分析平臺(www.majorbio.com，上海美吉生物醫藥科技有限公司)進行Alpha多樣性分析，包括Shannon指數、Simpson指數、ACE指數和Chao l指數；采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析，并統計各樣本的物種組成和相對豐度，繪制柱狀圖和韋恩圖。

2 結果與分析

2.1 冬小包腳菇子實體分子鑒定

經PCR擴增和序列測定，結果顯示供試冬小包腳菇菌株rDNA ITS區段長度為640 bp，上傳GenBank得到登錄號為OM108495，經Blast比對，與Volvopluteus gloiocephalus和Volvariella gloiocephala相似性較高，下載相似序列20條，并結合托光柄菇屬(Volvopluteus)、包腳菇屬(Volvariella)及光柄菇科下光柄菇屬(Pluteus)常見種序列，共同構建冬小包腳菇系統發育樹。由圖2可知，該系統發育關系可分為三大類群，包腳菇屬、托光柄菇屬和光柄菇屬各為一個類群，且冬小包腳菇屬于托光柄菇屬類群；若分為兩大類群，包腳菇屬和托光柄菇屬在同一類群，為傳統定義的包腳菇屬，光柄菇屬單獨為一個類群，既冬小包腳菇屬于傳統定義的Volvariella類群。

圖2 基于ITS序列構建的冬小包腳菇系統發育樹

2.2 菌基土壤理化性質分析

由表1可知，冬小包腳菇不同生長發育期菌基土壤全氮、全磷、全鉀含量無顯著差異(P＞0.05)。土壤速效養分指標堿解氮、速效鉀和有機質均表現為先增加后減少的趨勢，伸長期(L2)最高，自溶期(A4)最低。有效磷含量表現為成熟期(M3)＞伸長期(L2)＞自溶期(A4)＞蛋形期(E1)，成熟期(M3)和伸長期(L2)的含量顯著高于自溶期(A4)和蛋形期(E1)。冬小包腳菇菌基土壤顯弱酸性，不同生長期pH值波動較小，在6.45～7.02之間。

表1 冬小包腳菇土壤理化性質

2.3 野生冬小包腳菇菌基土壤微生物多樣性分析

如圖3A所示，冬小包腳菇菌基土壤中共獲得2 645個細菌OTUs，4個生長階段依次分別有2 590、2 579、2 579、2 578個OTUs。冬小包腳菇各生長階段菌基土壤共有OTUs為2 462個，蛋形期(E1)特有14個OTUs，伸長期(L2)特有6個OTUs，成 熟 期(M3)和 自 溶 期(A4)特 有1個OTU。

如圖3B所示，冬小包腳菇菌基土壤中共獲得590個真菌OTUs，4個生長階段依次分別有454、473、460、444個OTUs。冬小包腳菇不同生長階段菌基土壤共有OTUs為309個，蛋形期(E1)特有18個OTUs，伸長期(L2)特有28個OTUs，成熟期(M3)特有8個OTUs，自溶期(A4)特有21個OTUs。

圖3 細菌(A)、真菌(B)OTU樣本分布韋恩圖

如表2所示，各樣品細菌的覆蓋度均大于98.00%，真菌覆蓋度均大于99.00%，能夠代表相應樣本中細菌和真菌的真實信息。細菌和真菌的Shannon指數和Simpson指數在冬小包腳菇不同生長發育階段間差異不顯著(P＞0.05)。從豐富度指數可以看出，細菌的ACE指數和Chao 1指數在冬小包腳菇不同生長階段間差異不顯著(P＞0.05)；真菌的ACE指數和Chao 1指數在冬小包腳菇不同生長階段間存在差異，整體表現為先增加后下降的趨勢，均在成熟期(M3)達到最大值，說明成熟期冬小包腳菇菌基土壤真菌群落最為豐富。

表2 冬小包腳菇菌基土壤微生物群落Alpha多樣性分析

2.4 野生冬小包腳菇菌基土壤微生物群落結構分析

冬小包腳菇菌基土壤細菌共鑒定出22個綱，豐富度排名前十的綱按占比依次分別為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)13.36%(該值為各生長階段平均值，下同)、低溫丙型變形細菌綱(Gamma-proteobacteria)11.85%、放線菌綱Actinobacteria 11.24%、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)7.54%、Vicinamibacteria 7.50%、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)6.14%、酸微菌綱(Acidimicrobiia)3.15%、擬桿菌綱(Bacteroidia)2.74%、酸桿菌綱(Acidobacteriae)2.41%、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)2.27%(圖4A)。隨著冬小包腳菇的生長發育，菌基土壤細菌中α-變形菌綱、低溫丙型變形細菌綱、放線菌綱的占比整體表現為逐漸下降的趨勢，不同生長發育期間其他細菌門相對豐度差異均較小。

如圖4B所示，冬小包腳菇菌基土壤真菌共鑒定出11個綱，豐富度排名前十的綱占比依次分別為糞殼菌綱(Sordariomycetes)38.76%、盤菌綱(Pezizomycetes)18.97%、被孢霉綱(Mortierellomycetes)17.03%、座 囊 菌 綱(Dothideomycetes)6.19%、錘舌菌綱(Leotiomycetes)5.87%、傘菌綱(Agaricomycetes)4.90%、羅茲菌門未確定綱(unclassified_p_Rozellomycota)2.02%、油壺菌綱(Olpidiomycetes)1.60%、被孢霉門未確定綱(unclassified_p_Mortierellomycota)1.32%、散囊菌綱(Eurotiomycetes)1.16%。各生長階段，糞殼菌綱為主要優勢類群，盤菌綱和被孢霉綱在冬小包腳菇不同生長期的分布存在差異，具體表現為蛋形期(E1)和伸長期(L2)糞殼菌綱和被孢霉綱為優勢綱，成熟期(M3)和自溶期(A4)糞殼菌綱和盤菌綱為優勢綱。隨著冬小包腳菇的生長發育，菌基土壤真菌中糞殼菌綱和被孢霉綱占比表現為下降趨勢，盤菌綱整體表現為逐漸增加的趨勢。

圖4 土壤細菌(A)、真菌(B)綱水平上組成差異

如圖5A，在屬水平上，冬小包腳菇菌基土壤細菌群落中優勢屬為norank_f_norank_o_Vicinamibacterales(分類學譜系中未分類的科學名稱，標記為unclassified；分類系統中無該類層級的科學名稱，標記為norank)，占比超過1.00%的屬有16個。冬小包腳菇菌蛋形期(E1)土壤中norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、norank_f_KD4-96、unclassified_f_Intrasporangiaceae、Gaiella為優勢細菌群落(相對豐度＞2.00%)，伸長期(L2)土壤中norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、norank_f_KD4-96、norank_f_Gemmatimonadaceae為優勢細菌群落；成熟期(M3)菌基土壤中norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、norank_f_Vicinamibacteraceae、norank_f_KD4-96、unclassified_f_Intrasporangiaceae為優勢細菌群落；自溶期(A4)norank_f_norank_o_Vicinamibacterales、norank_f_67-14、Gaiella、norank_f_KD4-96為優勢細菌群落。不同生長發育期其他細菌屬相對豐度存在一定差異，norank_f_norank_o_Vicinamibacterales的相對豐度在冬小包腳菇不同生長發育期菌基土壤中都超過2.00%，為共有優勢群落。但細菌群落相對豐度都低于6.00%，且在屬水平上未知分類細菌在48.00%以上。

如圖5B，冬小包腳菇菌基土壤真菌群落優勢屬為被孢霉屬(Mortierella)，占比超過2.00%的屬有11個。蛋形期(E1)菌基土壤中被孢霉屬、Pseudaleuria屬、瓶毛殼屬(Lophotrichus)為優勢真菌群落(相對豐度＞10%)；伸長期(L2)菌基土壤中被孢霉屬、Pseudaleuria屬為優勢真菌群落；成熟期(M3)菌基土壤中被孢霉屬、Pseudaleuria屬、瓶毛殼屬為優勢真菌群落；自溶期(A4)菌基土壤中被孢霉屬、Pseudaleuria屬為優勢真菌群落。冬小包腳菇不同生長發育期屬相對豐度存在一定差異，被孢霉屬和Pseudaleuria屬的相對豐度在菌基土壤中均超過10.00%，為共有優勢群落。

圖5 土壤細菌(A)、真菌(B)屬水平上的熱圖分析

2.5 土壤真菌、細菌優勢屬與土壤理化因子相關性分析

選擇在分類水平總豐度前8的門，評估冬小包腳菇菌基土壤細菌、真菌與環境變量之間的相關性。由表3可知，冬小包腳菇菌基土壤細菌中綠彎菌門與土壤pH值呈顯著負相關；厚壁菌門與土壤全磷、有效磷含量呈顯著正相關；擬桿菌門與土壤堿解氮含量呈顯著正相關。其他細菌群落與土壤理化性質之間的相關性不顯著。土壤真菌優勢門與土壤理化因子相關性分析結果顯示，羅茲菌門與土壤全氮、全鉀含量呈顯著或極顯著正相關；油壺菌門與土壤全磷含量呈顯著正相關；壺菌門與土壤全氮、全鉀、有機質含量呈顯著或極顯著負相關；捕蟲霉門與土壤有效磷含量呈顯著正相關。

表3 土壤微生物優勢門與土壤理化因子相關性分析

3 討論與結論

對冬小包腳菇進行系統發育關系研究發現，其屬于Volvopluteus類群，也可屬于傳統定義的Volvariella類群。Volvopluteus是2011年由Justo等[11，12]從傳統Volvariella類群中分出來的新類群，而冬小包腳菇早在1987年就已被命名。在系統發育關系中，冬小包腳菇同粘蓋草菇親緣性較近，但兩者在子實體菌蓋顏色和發生季節等方面都存在明顯差異[13]。在不同生長發育期的菌基土壤中也發現了一定量的Volvopluteus類群序列，這說明冬小包腳菇菌基土壤中含有大量自身菌絲，這也是冬小包腳菇出菇的前提。

微生物群落多樣性研究表明，在冬小包腳菇不同生長發育階段菌基土壤真菌物種豐富度ACE指數和Chao 1指數存在明顯差異，整體表現為先增加后下降的趨勢，均在成熟期(M3)達到最大值。土壤細菌類群中，變形菌門的α-變形菌綱和低溫丙型變形細菌綱、放線菌門的放線菌綱和嗜熱油菌綱、綠彎菌門的厭氧繩菌綱、酸桿菌門的Vicinamibacteria綱均占明顯優勢，與趙玉卉等[14]對野生羊肚菌Morchella vulgaris根際細菌類群的研究結果一致。變形菌門分布廣泛，是土壤中豐度最大的細菌之一，也是土壤中多種化學循環的重要參與者[15]，其可能在冬小包腳菇菌基土壤的化學循環過程具有一定的作用。真菌類群中，子囊菌門的糞殼菌綱、盤菌綱、座囊菌綱、錘舌菌綱，被孢霉門的被孢霉綱，擔子菌門的傘菌綱占明顯優勢，主要是由于稻草還田造成農田土壤中木質纖維素的含量增加，促使子囊菌門和擔子菌門成為土壤真菌的優勢類群[16]。但是菌基土壤中未定義的綱仍占有一定比例，表明菌基土壤中仍存在大量的未知細菌和真菌。

冬小包腳菇不同生長發育期優勢菌屬有一定的差異，但存在一些共有的類群。已知共有細菌類群主要有分枝桿菌屬(Mycobacterium)、棒狀桿菌屬(Rokubacteriales)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、間孢囊菌屬(Intrasporangium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、節桿菌屬(Arthrobacter)、硫桿菌屬(Thiobacillus)等。間孢囊菌屬某些菌株可顯著降低土壤中鉻的毒性，能獨特地產堿性纖維素酶降解稻草中纖維素供冬小包腳菇生長[17，18]。鞘氨醇單胞菌屬中的鞘氨醇單胞菌(Pseudomonas paucimobil)在降解環境污染物、抗氧化衰老、與植物互作等領域發揮重要作用[19，20]。楊倩倩等[21]對褐環乳牛肝菌(Suillus luteus)根際土進行研究發現，節桿菌屬的P6菌株能高效降解土壤中的有機磷，表明食用菌可以通過影響菌基解磷細菌的種類來改善磷營養狀況。菌基土壤共有的主要真菌為被孢霉屬、Pseudaleuria屬、瓶毛殼屬、綠核菌屬(Ustilaginoidea)、翅孢殼屬(Emericellopsis)、托光柄菇屬、Pseudeurotium屬等。被孢霉屬為主要優勢真菌，可能是由于該屬大多數種類是嗜冷真菌，長期施肥能導致農田土壤被孢霉屬的豐度大量增加[22，23]。被孢霉屬某些類群是重要的解磷真菌，能夠從土壤中釋放磷、緩解土壤酸化、降解穩定且難分解的有機物，對促進養分循環和保持土壤肥力具有重要作用[24-26]。綠核菌屬的稻綠核菌(Ustilaginoidea virens)能侵染水稻穗部引發稻曲病，稻曲病不僅影響水稻產量和質量，還可產生毒素威脅人畜健康[27，28]。

在冬小包腳菇生長的過程中，土壤pH值逐漸減低，全氮和全磷含量表現為先增加后減少的趨勢，成熟期全氮和全磷含量最高，這與蘇德偉等[29]研究棘托竹生長土壤養分的變化結果一致；土壤pH值逐漸減低可能與冬小包腳菇生長發育過程中的代謝產物有關。在冬小包腳菇不同生長階段菌基土壤中細菌豐度較高的變形菌門和放線菌門與土壤理化因子間無顯著相關性，這與李艷春等[30]對茶園間作靈芝中土壤、魏艷晨等[31]對珍珠豬毛菜根際土壤的研究結果一致。厚壁菌門與土壤全磷、有效磷含量呈顯著正相關，表明其更適合生存于磷含量較高的土壤。子囊菌門、擔子菌門與大部分土壤養分元素無明顯相關性，說明這類菌群對外界環境適應性較好，可能與冬小包腳菇生長在收割完水稻輪作的農田里，水稻秸稈還田和追加農家肥提供了其充足的養分有關。

本研究明確了冬小包腳菇不同生長發育階段菌基土壤細菌、真菌的多樣性及群落結構，分析了土壤和主要微生物類群的關系。下一步研究中應選擇更為系統和科學的方法，研究微生物群落、環境因子與冬小包腳菇出菇關系，探索影響冬小包腳菇人工栽培的關鍵因子。