超表達StRab5b基因對馬鈴薯耐鹽生理特性的影響

范俊臣，張之為

(內蒙古農業大學園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)是茄科茄屬一年生草本植物，是我國第四大糧食作物，2020年全國29個省(直轄市、自治區)馬鈴薯種植面積為559.6萬公頃，總產量12 294.4萬噸[1]，在保障國家糧食安全和農民增收中具有不可代替的作用[2]。

馬鈴薯對鹽中度敏感，鹽害會抑制植株生長發育，甚至導致植株死亡[3]，大大降低馬鈴薯產量和品質，嚴重制約馬鈴薯產業發展。因此，研究馬鈴薯對鹽脅迫的響應機理具有重要意義。

研究表明，鹽脅迫下，植物葉片出現褐色或棕色斑點甚至萎蔫卷曲，葉片色素被破壞，同時氣孔收縮，限制了二氧化碳進入，影響光合作用，且長期脅迫下造成根系壞死，導致植物死亡[4-6]；鹽脅迫下，過量Na+、Cl-等離子對細胞產生離子毒害作用，影響植株對其他離子的吸收，而且形成的滲透壓脅迫會引起細胞水勢變化，導致植物失水[7，8]；此外，鹽脅迫會造成植物體內大量活性氧積累，打破自由基產生與清除這一動態平衡，導致膜脂過氧化，丙二醛(MDA)大量增加，造成膜系統損傷甚至瓦解，對植物體造成嚴重傷害[9-11]。超氧化物歧化酶(SOD)是植物抗氧化酶系統的第一道防線，在清除活性氧過程中發揮關鍵作用；過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)也是植物體內重要的抗氧化酶，可與SOD共同作用清除鹽脅迫下產生的活性氧和自由基，從而降低過氧化傷害[10]。因此，MDA含量及SOD、POD、CAT活性常被用作衡量植物耐鹽性的生理指標。

小G蛋白(small GTPases)是一類單體GTP結合蛋白，分子量為20～30 kD，依據功能可分為5個家族，即Ras、Rho、Rab、Arf和Ran家族[12]。Rab蛋白是小G蛋白家族最大的亞家族，在膜轉運過程中起著重要作用[13]，并可與效應子相互作用，在細胞生長發育、極性運輸、逆境脅迫反應等中發揮重要的調控功能[14]。Tripathy等[15]發現在水稻中超表達PgRab7基因，可使植株SOD、APX和CAT活性提高，從而表現出耐鹽和耐旱的特征；El-Esawi等[16]研究表明，轉OsRab7基因水稻植株的相對含水量、葉綠素含量、氣體交換特性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和抗氧化酶(CAT、SOD、POD、APX)活性顯著高于野生型，表現出耐鹽、耐旱和耐高溫的特性，同時產量增加。

本研究以超表達StRab5b基因馬鈴薯為材料，經過NaCl脅迫處理后分析植株含水量、抗氧化酶活性及MDA含量的變化，以明確StRab5b基因在馬鈴薯響應鹽脅迫中的調控作用，為馬鈴薯耐鹽性研究提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年6—8月在呼和浩特市內蒙古農業大學園藝與植物保護學院分子植物病理實驗室進行。供試材料為超表達StRab5b基因的馬鈴薯株系L7、L8、L10，品種為夏坡蒂，已經過qPCR鑒定[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽脅迫處理 選取在MS固體培養基中生長4周的馬鈴薯組培苗，取出洗凈根系，在清水中緩苗3 d，然后置于裝有30 mL 150 mmol/L NaCl的組培瓶中，每瓶6株，重復3次，以轉空載體馬鈴薯為對照(CK)，置于光照16 h、黑暗8 h、溫度22℃、濕度80%條件下培養，在處理0、24、48 h采集植株樣品測定相應理化指標。

1.2.2 植株含水量的測定 吸干采集樣品表面水分，稱鮮重，然后置于80℃烘干至恒重，稱干重。按公式[18]計算含水量:植株含水量(%)＝(植株鮮重-植株干重)/植株鮮重×100。

1.2.3 生理生化指標的測定 SOD活性測定采用氮藍四唑光化還原法[19]，POD活性測定采用愈創木酚法[19]，CAT活性測定采用紫外分光光度法[19]。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.3 數據分析

采用GraphPad Prism 8軟件作圖，利用SPSS 26.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同時間鹽脅迫對超表達StRab5b基因馬鈴薯幼苗含水量的影響

經過150 mmol/L NaCl處理后，觀察不同時間內植株的生長，結果(圖1)顯示，未經脅迫時，轉基因馬鈴薯L7、L8、L10與CK均為正常生長形態，葉片舒展未發生皺縮；脅迫處理24 h，L7、L8、L10的葉片開始輕微皺縮，而CK的葉片未發現明顯皺縮；脅迫處理48 h，L7、L8、L10和CK的葉片均開始皺縮，L7、L8、L10的葉片皺縮程度明顯高于CK。

圖1 超表達SbRab5b基因馬鈴薯在鹽脅迫處理后的植株表型

從圖2可知，隨著NaCl處理時間的延長，轉StRab5b基因馬鈴薯與CK植株含水量均呈降低趨勢。在處理0 h，CK與轉基因馬鈴薯株系L7、L8、L10的含水量沒有顯著差異；處理24 h，與CK相比，L7、L8、L10的含水量分別顯著下降12.5%、17.6%、24.6%；處理48 h，與CK相比，L7、L8、L10的含水量分別顯著下降31.7%、36.2%、42.8%。說明鹽脅迫條件下，超表達StRab5b基因降低了馬鈴薯幼苗的植株含水量。

圖2 鹽脅迫下超表達StRab5b基因馬鈴薯的含水量變化

2.2 鹽脅迫下超表達StRab5b基因馬鈴薯的抗氧化酶活性變化

2.2.1 SOD活性的變化 如圖3所示，經過150mmol/L NaCl處理后，隨著鹽脅迫時間的延長，轉基因馬鈴薯L8的SOD活性先降后升，CK、L7的SOD活性呈遞增趨勢，而L10的活性先升后降。鹽脅迫處理0 h，CK與轉基因馬鈴薯L7、L8、L10的SOD活性沒有顯著差異；在處理24 h，與CK相比，L7、L8、L10的SOD活性分別顯著下降66.7%、81.1%、29.5%；在處理48 h，與CK相比，L7、L8、L10的SOD活性分別顯著下降54.4%、48.8%、80.3%。總體來說，在鹽脅迫下，超表達StRab5b基因降低了馬鈴薯幼苗的SOD活性。

圖3 鹽脅迫下超表達StRab5b基因馬鈴薯的SOD活性變化

2.2.2 POD活性 如圖4所示，在150 mmol/L NaCl處理下，隨著鹽脅迫時間的延長，CK的POD活性呈遞增趨勢，轉基因馬鈴薯L7、L10的活性呈先降后升趨勢，而L8的活性先升后降。在處理0 h，CK與轉基因馬鈴薯L7、L8、L10的POD活性沒有顯著差異；在處理24 h，與CK相比，L7、L8、L10的POD活性分別顯著下降50.6%、16.6%、37.8%；在處理48 h，與CK相比，L8的POD活性顯著下降29.1%，而L7的POD活性顯著增加54.2%，L10的POD活性上升13.0%，但與CK差異不顯著。可見，在鹽脅迫初期，超表達StRab5b基因降低了馬鈴薯幼苗的POD活性，但在脅迫后期，不同轉基因株系的反應不同，L8的POD活性降低，而L7和L10的POD活性升高。

圖4 鹽脅迫下超表達StRab5b基因馬鈴薯的POD活性變化

2.2.3 CAT活性的變化 如圖5所示，在150mmol/L NaCl處理下，隨著鹽脅迫時間的延長，CK與L10的CAT活性呈遞增趨勢，而L7、L8的CAT活性均呈先升后降的趨勢。在處理0 h，CK與轉基因馬鈴薯L7、L8、L10的CAT活性沒有顯著差異；在處理24 h，與CK相比，L7、L8的CAT活性分別上升45.2%、25.8%，差異顯著，L10的CAT活性略有降低，差異不顯著；在處理48 h，與CK相比，L7、L8、L10的CAT活性顯著降低62.9%、75.7%、32.8%。可 見，鹽 脅 迫 初 期，超 表 達StRab5b基因的馬鈴薯CAT活性升高，但在脅迫后期大幅降低。

圖5 鹽脅迫下超表達StRab5b基因馬鈴薯的CAT活性變化

2.3 鹽脅迫下超表達StRab5b基因馬鈴薯的MDA含量變化

由圖6可知，在150 mmol/L NaCl處理下，隨著鹽脅迫處理時間的延長，CK和轉基因馬鈴薯L7、L8、L10的MDA含量均呈現遞增趨勢。在處理0 h，四者的MDA含量沒有顯著差異；在處理24、48 h，與CK相比，L7、L8、L10的MDA含量均顯著增加，分別增加了193%、80%、265%和218%、179%、295%。可見，在鹽脅迫下，超表達StRab5b基因馬鈴薯的MDA含量大幅增加，脅迫時間越長MDA含量越高。

圖6 鹽脅迫下超表達StRab5b基因馬鈴薯的MDA含量變化

3 討論與結論

馬鈴薯屬于鹽中度敏感作物，鹽脅迫對其生長的影響主要表現在使長勢變弱、葉片萎蔫發黃[21]。已有研究[22]表明，在鹽脅迫下，過表達抗逆基因StSnRK2.1、StSnRK2.7可明顯提高馬鈴薯的抗逆性，其株高、鮮重及相對含水量的降幅顯著低于對照。而在本試驗中，隨著鹽脅迫時間的延長，超表達StRab5b基因的馬鈴薯L7、L8、L10均出現較為嚴重的萎蔫，植株含水量顯著降低，對鹽脅迫的抵抗力明顯降低。

鹽脅迫對植物生理生化反應的影響主要表現在滲透調節、光合作用、氧化活性等方面[23]。鹽脅迫會導致植物產生大量活性氧，若不能及時清除，就會引發脂質過氧化和蛋白交聯，進而損害細胞膜結構和功能的完整性，對植物細胞產生氧化毒害作用。SOD、POD和CAT能有效清除活性氧，降低活性氧對細胞的傷害[10]。本試驗中，在NaCl脅迫處理48 h后，對照植株的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均明顯提高，清除活性氧的能力強；但超表達StRab5b基因的馬鈴薯株系中SOD和CAT活性顯著低于對照植株，而POD活性3個株系間表現不同，L7、L10升高，L8下降。綜合推測StRab5b基因在馬鈴薯植株清除活性氧上表現為負調控，超表達該基因抑制了抗氧化酶的活性，使植物體清除活性氧的能力減弱。

作為膜脂過氧化的主要產物，MDA積累量與植物受逆境傷害程度呈正比關系，植物受傷害程度越小，MDA積累量越小，反之則越大[24]。張景云等[25]在鹽脅迫二倍體馬鈴薯葉片中發現MDA含量隨鹽脅迫時間的延長呈逐漸升高趨勢。本試驗結果也表明，馬鈴薯植株體內的MDA含量隨著NaCl脅迫時間的延長而增加，且超表達StRab5b基因的植株體內MDA積累量更高。

綜上所述，在150 mmol/L NaCl脅迫下，超表達StRab5b基因馬鈴薯的抗氧化能力受到明顯抑制，遭受鹽脅迫傷害更嚴重，推測StRab5b基因負向調控馬鈴薯對于鹽脅迫的抗性。