小麥花粉的低溫和超低溫保存研究

王慧 張從合 汪和廷 黃艷玲 嚴 志 管昌紅

（安徽荃銀高科種業股份有限公司/農業農村部雜交稻新品種創制重點實驗室，合肥 230088）

小麥是最重要的糧食作物之一，也是目前尚未大規模開展雜種優勢利用的作物之一，雜交小麥是小麥雜種優勢利用的具體形式，一般可以使小麥產量提高15%～30%，大面積推廣雜交小麥對確保國家糧食安全有著重要的意義[1-2]。雜交小麥種子生產過程中提高不育系結實粒數是提高制種產量的主要途徑之一[3-4]。多年來，相關單位積極開展了雜交小麥的高產制種技術研究，針對不同的親本組合開展花期調節、授粉技術、隔離技術、父母本行比、機械化混播制種等[1，5-8]，但仍然存在制種成本較高、受環境影響較大且種子質量不達標的風險，不利于雜交小麥的推廣和機械化制種。因此，建立以高產、低成本為目標的規模化、機械化、標準化的雜交小麥種子生產技術體系非常迫切。

如果能夠將小麥花粉進行集中收集、保存并保持其花粉活力，將會推進雜交小麥的應用進程。據統計，國內外已對包括主要農作物在內的170 多種植物開展了花粉超低溫保存技術研究，并將超低溫保存的花粉成功用于雜交育種研究[9-11]。研究過程中發現花粉種間特異性很強，不同作物需要不同技術方案，沒有一種技術方案可以適宜所有花粉的保存[12]。小麥屬于禾本科作物，其離體花粉活力幾個小時內迅速降低，壽命很短，不利于花粉活力研究和育種工作的開展，目前僅有關于八倍體小黑麥花粉的保存研究[12]，關于普通小麥花粉保存技術的研究未見成功報道。如果采用低溫或超低溫冷凍技術延長小麥花粉壽命，為加速小麥雜交育種進程和種質資源的保存提供更好的途徑，將會有很大的應用價值。

本研究對小麥花粉進行采集，初步開展了小麥花粉的干燥條件、花粉低溫和超低溫保存條件以及小麥花粉保存后的復蘇及雜交授粉研究等，旨在確立適合的小麥花粉保存方法，為雜交小麥育種，尤其是跨時間、跨地區的雜交育種提供方便，同時為禾本科作物花粉的長期保存提供理論依據和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試小麥材料為鎮麥168 和寧麥13。分別于2020 年和2021 年11 月上旬種植于荃銀高科種業股份有限公司合肥南崗試驗田和滁州市定遠縣東昌試驗田，其中鎮麥168 集中種植于南崗試驗田用于花粉采集，寧麥13 同時種植于兩地（南崗試驗田和東昌試驗田），采用常規田間管理。

1.2 花粉收集和干燥2021 年和2022 年4 月上旬鎮麥168 小麥盛花期，選擇晴朗天氣，于10：00-12：00 和16：00-18：00 利用自制花粉采集裝置[13]采集花粉至培養皿中，并迅速帶回實驗室內進行干燥處理（溫度20℃、濕度25%）。設置5 種干燥處理時間：0h、1h、1.5h、3h、5h。

1.3 花粉保存和復蘇取不同干燥時間的花粉，將對應培養皿進行密封并裝入鋁箔復合袋中，設3 種溫度條件：4℃（4℃冰箱低溫冷藏保存）、-20℃（-20℃冰箱低溫冷凍保存）和-196℃（液氮超低溫冷凍保存）。間隔不同時段（2d、4d、7d 和368d）后取出花粉進行花粉復蘇。復蘇方式分別為自來水沖洗復蘇、室溫自然復蘇（25℃）和35℃水浴復蘇，待保存花粉復蘇至室溫后進行雜交授粉試驗。

1.4 雜交授粉提前對兩地種植的寧麥13 進行剪穗去雄并套袋，將不同處理的復蘇后花粉授粉于袋中的寧麥13 穗子，授粉后繼續套袋隔離，每個處理設置20 次重復。

1.5 調查指標及數據分析授粉后，待成熟期調查統計小麥每穗結實粒數；所有試驗數據均采用Excel軟件進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 干燥時間對小麥花粉授粉效果的影響為了確定合適的花粉干燥時間，將花粉經過不同時長的干燥后，分別置于4℃、-20℃和-196℃保存2d，采用室溫（25℃）自然復蘇花粉并進行雜交授粉，用新鮮花粉（干燥0h 未保存）作為對照，統計授粉后每穗結實粒數。結果如圖1 所示，在溫度20℃、濕度25%下干燥0h、1h、1.5h、3h 和5h 的花粉授粉均有結實，其中干燥0h、1h 和1.5h 每穗結實粒數差異不大，分別為28 粒、27 粒和24 粒，干燥3h 之后已嚴重影響授粉結實，干燥5h每穗結實數僅為1粒；4℃保存花粉除了干燥0h、1h 有結實外，其余處理均無結實；-20℃和-196℃保存的花粉干燥0h 和1h 每穗結實數均超過20 粒，干燥1.5h 之后隨著干燥時間的延長，每穗結實粒數逐漸降低，干燥5h 保存2d 后授粉不結實。

圖1 不同干燥時間和保存條件對小麥授粉結實的影響

可見，花粉干燥時間對不同保存條件下小麥花粉授粉效果的影響較大。干燥3h 之后的花粉可能由于含水量過低導致花粉活力降低影響保存后授粉結實，干燥0h、1h、1.5h 均可進行-20℃和-196℃保存，其中干燥1h 對花粉活力影響最小，保存授粉結實效果最好。4℃保存條件下除了0h、1h，其余干燥時間均不結實，達不到育種需求。因此干燥1h是低溫冷凍和超低溫冷凍保存花粉高活力的最優干燥時間。

2.2 不同解凍復蘇處理方式對每穗結實粒數的影響取干燥1h 的4℃（低溫冷藏）、-20℃（低溫冷凍）和-196℃（超低溫冷凍）保存2d 的花粉，分別用自來水沖洗復蘇、室溫（25℃）自然復蘇和35℃水浴復蘇3 種方法進行花粉復蘇處理，并授粉于去雄的寧麥13 進行雜交試驗。結果如圖2 所示，-20℃保存后采用室溫（25℃）自然復蘇平均每穗結實粒數最高，其次是35℃水浴復蘇，而采用自來水沖洗復蘇花粉授粉平均每穗結實粒數最低。-196℃保存后采用35℃水浴復蘇平均每穗結實粒數最高，其次是室溫（25℃）自然復蘇，采用自來水沖洗復蘇花粉授粉平均每穗結實粒數最低。4℃保存后花粉不同復蘇方式的結實粒數均較低。其中-20℃保存的花粉室溫（25℃）自然復蘇與35℃水浴復蘇授粉平均每穗結實粒數僅相差2 粒，-196℃保存的花粉室溫（25℃）自然復蘇與35℃水浴復蘇授粉平均每穗結實粒數僅相差1 粒，但這兩種復蘇方法的授粉平均每穗結實粒數均高于自來水沖洗復蘇。可見，采用室溫（25℃）自然復蘇是簡便適合的小麥花粉復蘇方式。

圖2 不同復蘇方式對小麥授粉結實的影響

2.3 不同保存時間對每穗結實粒數的影響將收集的鎮麥168 花粉在溫度20℃、濕度25%、干燥1h后，分別于4℃、-20℃以及-196℃保存2d、4d、7d 和368d，取出進行室溫（25℃）自然復蘇并授粉去雄的寧麥13。結果如圖3 所示，4℃保存2d 的花粉授粉后平均每穗結實粒數僅2 粒，保存至4d 之后均不結實；-20℃保存7d 之內授粉平均每穗結實粒數變幅在21～23 粒之間，但保存1 年（368d）之后的花粉授粉結實粒數明顯降低；而-196℃保存2d 至368d 的花粉授粉后平均每穗結實粒數變幅在22～25粒之間，無明顯變化。可見，4℃除了保存2d 有結實外，其余均不結實，達不到育種需求；-20℃（低溫冷凍）環境可短期（7d）保存小麥花粉；而-196℃（超低溫冷凍）則適宜花粉的長期（368d）保存。

圖3 不同保存時間對小麥授粉結實的影響

2.4 保存花粉異地授粉及雜交種真實性驗證為了驗證-20℃（低溫冷凍）和-196℃（超低溫冷凍）的花粉在其他地區授粉結實的可行性，將-20℃和-196℃保存7d 的花粉放入存有干冰的低溫保溫箱中，從合肥運至滁州市定遠縣東昌試驗田，進行花粉室溫（25℃）復蘇后授粉于去雄的寧麥13，結果如表1 所示，定遠與合肥平均每穗結實粒數基本無差異，且與新鮮花粉授粉平均每穗結實粒數相差不大，僅相差1～4 粒，得出小麥花粉經過-20℃和-196℃保存后可進行異地授粉。為了驗證試驗結果的可靠性，避免由于去雄不干凈自交導致的試驗誤差，進一步對兩地收獲的雜交F1種子進行真實性驗證，利用NY/T 2470—2013《小麥品種鑒定技術規程 SSR分子標記法》進行檢測，結果表明雜交F1種子真實性均達到96.0%以上，試驗結果準確可靠。

表1 花粉保存后異地授粉結實及雜交種真實性

3 討論與結論

雜交小麥被認為是緩解極端天氣、提高小麥綜合生產能力的重要途徑[14-15]，已陸續審定了一批雜交小麥品種，并在生產上推廣應用，如2008 年綿雜麥168 以8565kg/hm2的產量刷新了四川盆地小麥單產新紀錄[14]。但是雜交小麥在應用中仍然存在著一些有待解決的科學和產業問題，其中規模化高效制種技術就是雜交小麥大面積推廣的重點和難點。為此，團隊提出將小麥花粉進行集中收集并在特殊的條件下保存，進而延長花粉壽命，可拓寬小麥配組育種的雙親生育期的差距，并拓寬雜交小麥的遺傳距離，為小麥育種的授粉雜交提供了方便，利于加速育種進程。同時，對于小麥產業特別是降低制種成本，克服雜交制種花期不育或花時不同步，提高土地利用率，提高機械化水平，完善種質資源的保存以及提升雜交小麥的雜種優勢利用等都具有非常重要的價值。

花粉干燥處理是低溫冷凍和超低溫保存花粉高活力的關鍵因素，不干燥或含水量過高花粉在結凍和化凍的過程中容易產生冰晶使細胞膜受損，而干燥時間過長又會導致花粉活力降低，導致低溫保存后的活力更低[12]。在農作物花粉的研究中，胡晉等[16]研究水稻花粉在10℃干燥3h 較適宜水稻恢復系花粉的超低溫保存。孫果忠[17]研究得出花粉含水量在11.3%～14.7%范圍是玉米花粉超低溫保存成功的關鍵。本研究通過采集小麥花粉，采用在溫度20℃、濕度25%條件下進行干燥處理，得出干燥1h 再低溫冷凍保存和超低溫保存授粉后平均每穗結實粒數與對照基本相同。

花粉超低溫保存后復蘇化凍處理也是決定花粉活力高低的關鍵因素，較好的復蘇方式既能避免化凍過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的破壞，又能防止花粉細胞內的再次結冰[12]。王彩紅等[18]采用不同溫度復蘇杏花粉，得出含水量越高的材料復蘇溫度越高。本研究初步得出-196℃保存的小麥花粉適宜35℃水浴復蘇，-20℃保存的花粉則更適宜室溫（25℃）自然復蘇。

本研究采用儲存后花粉直接進行雜交授粉的方法，雖然不能非常精確反映出花粉生活力[19]，但這是最能指導實際生產的方法，也是最有效的檢測方法。本試驗中不同保存條件對花粉的授粉結實影響不同，4℃低溫冷藏環境不利于小麥花粉保存，-20℃低溫冷凍保存隨著保存時間延長至7d，花粉授粉結實粒數較對照無明顯變化，花粉活力基本不變，而保存時間延長至1 年（368d）花粉活力明顯降低，得出-20℃有利于花粉的短期（7d）保存。由于7d 和368d 間隔時間過大，-20℃是否適合7d 以上的保存時間還有待進一步的研究。-196℃液氮保存1 年（368d）對花粉的授粉效果影響不大，說明-196℃適宜花粉的長期保存。在生產中可以根據不同目的選擇經濟合適的保存方法。本研究對小麥花粉進行低溫和超低溫保存比較試驗，為雜交小麥制種提供了重要的技術支撐。

團隊初步研究了小麥花粉低溫冷藏、低溫冷凍保存和超低溫冷凍保存技術，首先對小麥花粉進行短期和長期保存，研究保存后的花粉對雜交授粉結實影響，發現小麥花粉低溫冷凍保存和超低溫冷凍保存具有可行性。初步結論如下：（1）小麥花粉不干燥（干燥0h）可以直接進行低溫冷凍和超低溫保存；在溫度20℃、濕度25%條件下，干燥1h 是低溫冷凍和超低溫保存后花粉高活力的最優干燥時間。（2）4℃不利于小麥花粉的保存，-20℃（低溫冷凍）可短期（7d）保存小麥花粉，-196℃（超低溫冷凍）適宜花粉的長期（368d）保存。（3）-20℃（低溫冷凍）保存小麥花粉的最佳復蘇方式是室溫（25℃）自然復蘇；-196℃（超低溫冷凍）保存小麥花粉的最佳復蘇方式是35℃水浴復蘇，綜合采用室溫（25℃）自然復蘇是簡便適合的小麥花粉復蘇方式。（4）小麥花粉低溫冷凍和超低溫冷凍保存后，可異地授粉。