食品理化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的方法驗(yàn)證

楊舒雅

寶雞市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，寶雞市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（寶雞 721000）

方法驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室管理體系中至關(guān)重要的一項(xiàng)工作，方法驗(yàn)證過(guò)程受到人員、操作過(guò)程、儀器設(shè)備、試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、檢驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和設(shè)施等諸多因素的影響。從檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)現(xiàn)存問(wèn)題來(lái)說(shuō)，一方面，實(shí)驗(yàn)室對(duì)方法驗(yàn)證的重要性缺乏充分認(rèn)識(shí)，沒(méi)有進(jìn)行方法驗(yàn)證，直接進(jìn)入正式檢測(cè)程序，或者對(duì)方法驗(yàn)證的概念和操作過(guò)程不夠理解，對(duì)方法驗(yàn)證要素控制不規(guī)范等[1]，都會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不確定性，這種不確定性給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)隱患；另一方面，從食品理化檢測(cè)的方法驗(yàn)證國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)說(shuō)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所涉及相關(guān)內(nèi)容不多，也比較分散，對(duì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)范實(shí)施方法驗(yàn)證造成一些困擾。所以認(rèn)識(shí)方法驗(yàn)證的重要性，正確實(shí)施方法驗(yàn)證，對(duì)實(shí)驗(yàn)室良好有效的運(yùn)行有著重要意義。因此，從方法驗(yàn)證的重要性、技術(shù)參數(shù)要素的控制[2-3]，結(jié)合實(shí)例，對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證提出對(duì)策，為食品理化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證提供參考。

1 方法驗(yàn)證的重要性

1.1 方法驗(yàn)證的強(qiáng)制性

對(duì)于食品理化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，方法驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和資質(zhì)認(rèn)定時(shí)考核的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是擴(kuò)項(xiàng)時(shí)考查的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)，是檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)能力的重要反映。不管是RB/T 214—2017《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通用要求》，還是CNAS-CL01：2018《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》，都對(duì)方法驗(yàn)證做出明確要求，這是一個(gè)強(qiáng)制性的要求，也正說(shuō)明方法驗(yàn)證對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要性。

CNAS-CL01：2018實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則7.2.1.5規(guī)定[4]：實(shí)驗(yàn)室在引入方法前，應(yīng)驗(yàn)證能夠正確地運(yùn)用該方法，以確保實(shí)現(xiàn)所需的方法性能。如果發(fā)布機(jī)構(gòu)修訂方法，應(yīng)在所需的程度上重新進(jìn)行驗(yàn)證。RB/T 214—2017通用要求4.5.14規(guī)定[5]：檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)在使用標(biāo)準(zhǔn)方法前，應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)跟蹤方法的變化，并重新進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2 方法驗(yàn)證的必要性

明確方法驗(yàn)證的概念。GB/T 27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[6]規(guī)定“方法驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)室通過(guò)核查，提供客觀有效證據(jù)證明滿足檢測(cè)方法規(guī)定的要求”，而RB/T 214—2017《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通用要求》通用要求中“驗(yàn)證”的概念為“提供客觀的證據(jù)，證明給定項(xiàng)目是否滿足規(guī)定要求”。所以方法驗(yàn)證就是在采用新方法前或是標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)生更新后，進(jìn)行新方法的證實(shí)，通過(guò)操作該方法證實(shí)是否滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求，即證實(shí)該方法在現(xiàn)有或新購(gòu)置儀器設(shè)備的性能和精度、檢測(cè)人員的能力、試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的等級(jí)及純度、操作程序的適用性、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和環(huán)境等條件下能不能獲得令人滿意的檢測(cè)結(jié)果，分析該方法的適應(yīng)性。只有方法驗(yàn)證結(jié)論合格，才能運(yùn)用該方法，進(jìn)入正式檢測(cè)程序。因此方法驗(yàn)證的過(guò)程就是證明采用該方法能否獲得準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)的過(guò)程，從而保證實(shí)驗(yàn)室在采用該方法所需要的相關(guān)條件下，可以出具準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果。尤其對(duì)于對(duì)外提供檢測(cè)數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)來(lái)說(shuō)，方法驗(yàn)證的重要性更是不言而喻的。

1.3 方法驗(yàn)證對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的影響

在檢驗(yàn)檢測(cè)工作中，檢測(cè)方法的適用性直接決定檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。沒(méi)有經(jīng)過(guò)方法驗(yàn)證出具檢測(cè)結(jié)果，輕則造成檢測(cè)數(shù)據(jù)偏離，重則造成檢測(cè)結(jié)論出現(xiàn)錯(cuò)誤，可能將合格產(chǎn)品判定為不合格，而不合格的判定結(jié)果會(huì)對(duì)企業(yè)的經(jīng)營(yíng)和聲譽(yù)造成惡劣影響，同時(shí)這種錯(cuò)誤也會(huì)對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的公信力造成嚴(yán)重傷害。尤其是出現(xiàn)在一些涉及食品安全的執(zhí)法檢測(cè)案件及仲裁檢驗(yàn)等中，造成危害更大。所以有效進(jìn)行方法驗(yàn)證，不僅能確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，提高檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)實(shí)力，而且會(huì)有效降低檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)工作風(fēng)險(xiǎn)，避免造成不良后果。

2 方法驗(yàn)證的要素

2.1 線性及標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照測(cè)定條件進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，若采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，則標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點(diǎn)在5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)以上（不包括空白）；濃度范圍一般在關(guān)注濃度的0～150%（含空白）[6]；對(duì)于準(zhǔn)確定量的方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r在0.99以上（包含0.99）[7]，對(duì)于篩選方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r在0.98以上（包含0.98）[7]。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)獨(dú)立配制。待測(cè)組分含量不能超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作范圍。若待測(cè)組分含量低于或高于標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍，應(yīng)采取加大或減少稱樣量，減小或增大樣品處理液稀釋倍數(shù)等方法，使其含量處于標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍內(nèi)。以酒類中展青霉素的測(cè)定為例，方法依據(jù)GB 5009.185—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中展青霉素的測(cè)定》（第二法）[8]，儀器采用島津SPD-20A高效液相色譜儀。以山楂酒為樣品基質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)系列為5.00，10.0，25.0，50.0，100.0，150.0，200.0和250.0 ng/mL，測(cè)定結(jié)果為4.74，10.13，24.84，49.99，100.94，148.45，201.88和248.08 ng/mL，線性回歸方程為f（x）=0.001 678 62x+0.109 318，相關(guān)系數(shù)r=0.999 869 9，檢測(cè)結(jié)果符合要求。

2.2 檢出限和定量限

檢出限對(duì)于方法的測(cè)定范圍有重大意義。對(duì)于樣品中不允許存在的物質(zhì)的檢測(cè)方法、定性檢測(cè)方法以及進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，要驗(yàn)證方法的檢出限。對(duì)于目標(biāo)組分含量較低的檢測(cè)方法以及定量檢測(cè)方法，要驗(yàn)證方法的定量限。若方法中已有方法檢出限或定量限（SMDL），則直接驗(yàn)證該濃度水平，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)在SMDL±20%范圍內(nèi)[9]。檢出限和定量限的驗(yàn)證應(yīng)采用同濃度水平的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行驗(yàn)證。若方法未給出方法檢出限或定量限，應(yīng)盡可能測(cè)試多種方法進(jìn)行比較，采用合適的方法來(lái)測(cè)定檢出限或定量限。

檢出限的測(cè)定方法很多，有空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法、信噪比法、逐步稀釋法等。依據(jù)方法所使用儀器的不同選擇適用的方法。以葡萄酒中赭曲霉毒素A含量測(cè)定為例，方法依據(jù)GB 5009.96—2016《食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定》（第一法）[10]，儀器為Waters e2695高效液相色譜儀（2745檢測(cè)器）。試驗(yàn)前對(duì)赭曲霉毒素A免疫親和進(jìn)行柱效檢測(cè)，回收率為94.1%，則該批免疫親和柱滿足試驗(yàn)要求。該方法給出酒類檢出限為0.1 μg/kg，則加入0.04 mL赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品（50ng/mL）于空白樣品中進(jìn)行前處理，連續(xù)進(jìn)行11次重復(fù)性測(cè)試，測(cè)試數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。測(cè)定結(jié)果表明，11次重復(fù)性測(cè)試的偏差均在SMDL±20%范圍內(nèi)，該方法的檢出限可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，即該方法的檢出限為0.1 μg/kg。

表1 葡萄酒中赭曲霉毒素A檢出限的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)（n=11）

2.3 正確度

檢測(cè)結(jié)果的偏倚通過(guò)回收率進(jìn)行評(píng)估，即測(cè)定回收率可以進(jìn)行正確度評(píng)估。有質(zhì)控樣品的采用質(zhì)控樣品進(jìn)行正確度測(cè)試，沒(méi)有質(zhì)控樣品的進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定回收率來(lái)評(píng)估正確度。

2.3.1 回收率測(cè)定對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或符合要求的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，即在空白樣品基質(zhì)中加入已知含量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。回收率的測(cè)定對(duì)定量分析非常重要，直接影響檢測(cè)結(jié)果的正確度。如在某次六六六、DDT盲樣（樣品基質(zhì)為橙汁）考核檢測(cè)中，測(cè)得的數(shù)據(jù)為六六六28.8 μg/kg、DDT 57.1 μg/kg，而六六六滿意值范圍為32.5～80.5 μg/kg，DDT滿意值范圍為59.0～171 μg/kg，結(jié)果表明測(cè)定數(shù)據(jù)是偏離的。在分析數(shù)據(jù)偏離的原因時(shí)，在樣品處理環(huán)節(jié)，通過(guò)空白溶液加標(biāo)進(jìn)行樣品處理后測(cè)定回收率，回收率平均值為56%，低于60%～120%（目標(biāo)組分含量＜0.1 mg/kg）的規(guī)定要求，所以回收率偏低造成數(shù)據(jù)偏離。由此可見(jiàn)，回收率測(cè)定對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)影響較大。回收率的控制范圍見(jiàn)表2[7]。

表2 回收率控制范圍

2.3.2 回收率的測(cè)定

回收率測(cè)定時(shí)應(yīng)至少進(jìn)行低濃度、中間濃度、高濃度3個(gè)不同加標(biāo)量的測(cè)試，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定至少2次。對(duì)于有最高殘留量（MRL）限定，加標(biāo)量在方法定量限或定量限附近、方法定量限和MRL之間、MRL的3個(gè)不同濃度水平進(jìn)行回收率測(cè)定。以測(cè)定葡萄酒中紐甜含量為例，方法依據(jù)為GB 5009.247—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測(cè)定》[11]，儀器為島津SPD-20A高效液相色譜儀。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，樣品中紐甜含量2次重復(fù)性測(cè)試結(jié)果為0.000 156 g/kg和0.000 153 g/kg，而該方法定量限為0.000 2 g/kg，即樣品中紐甜含量小于定量限，可視為未檢出，所以采用在空白樣品中（該樣品可視為空白樣品）加入3個(gè)不同濃度水平標(biāo)液進(jìn)行加標(biāo)測(cè)試，每個(gè)濃度水平進(jìn)行2次重復(fù)性測(cè)試，葡萄酒中紐甜加標(biāo)試驗(yàn)（紐甜標(biāo)液質(zhì)量濃度100 μg/mL）的測(cè)試數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。測(cè)定結(jié)果表明，回收率試驗(yàn)符合方法驗(yàn)證要求。

表3 葡萄酒中紐甜液相色譜法加標(biāo)回收率的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)（n=2）

2.3.3 回收率的討論

回收率好并不能保證方法的正確度，而回收率差肯定表明方法的正確度差。一般來(lái)說(shuō)，若回收率低于60%～70%，應(yīng)對(duì)方法重新改進(jìn)，尤其是樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，從而提高回收率；若回收率大于110%，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行更好的分離來(lái)排除各種干擾因素的影響。

2.4 精密度測(cè)試

精密度試驗(yàn)包括重復(fù)性和再現(xiàn)性，分別用于衡量實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間精密度試驗(yàn)的符合性，以下內(nèi)容為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)性精密度試驗(yàn)。精密度通常以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD，%）表示。精密度測(cè)定時(shí)應(yīng)進(jìn)行低濃度、中間濃度、高濃度3個(gè)不同濃度水平的測(cè)試，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定次數(shù)不少于6次。對(duì)于有最高殘留量（SMRL）限定，精密度試驗(yàn)在方法檢出限、SMRL、選一合適點(diǎn)3個(gè)濃度水平進(jìn)行測(cè)定。精密度試驗(yàn)通過(guò)變異系數(shù)（C.V.）來(lái)評(píng)價(jià)，變異系數(shù)（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）按式（1）計(jì)算。

式中：C.V.為變異系數(shù)，%；S為標(biāo)準(zhǔn)偏差；Z為重復(fù)測(cè)定的平均值。變異系數(shù)控制范圍見(jiàn)表4[7]。

表4 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（C.V.）

以葡萄酒中紐甜的測(cè)定為例[11]，將3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)液加入空白樣品中，進(jìn)行7次重復(fù)性測(cè)試，通過(guò)重復(fù)測(cè)定的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算變異系數(shù)。葡萄酒中紐甜精密度測(cè)試數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。測(cè)定結(jié)果表明，變異系數(shù)符合要求，即精密度方法驗(yàn)證符合要求。

表5 葡萄酒中紐甜液相色譜法精密度的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)（n=7）

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)于方法驗(yàn)證參數(shù)的選擇，除了上述方法驗(yàn)證要素以外，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)條件選擇盡可能多的技術(shù)參數(shù)。對(duì)于儀器檢出限的確定方法，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)未做明確規(guī)定，有待進(jìn)一步研究。在日常檢測(cè)工作中，實(shí)驗(yàn)室要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的更新制定方法驗(yàn)證計(jì)劃，由專業(yè)人員負(fù)責(zé)驗(yàn)證計(jì)劃的實(shí)施和驗(yàn)證報(bào)告的審核。不論是新標(biāo)準(zhǔn)方法的方法驗(yàn)證，還是實(shí)驗(yàn)室參加能力驗(yàn)證或盲樣檢測(cè)等重要檢測(cè)活動(dòng)，應(yīng)按照方法驗(yàn)證的要素控制試驗(yàn)過(guò)程，使其符合相關(guān)規(guī)范要求，才能確保檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，從而有效提升實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測(cè)能力。