食品中的花青素及其與金屬離子的相互作用

朱曉路，陳文博，王玉玲，賈國超

鄭州工程技術學院（鄭州 450044）

富含酚類抗氧化劑的植物和食品，特別是水果、蔬菜和谷物被廣泛研究，因為它們在降低人類慢性和降解性疾病風險方面起著關鍵作用?；ㄇ嗨兀鳛樘烊皇称分珓┮咽褂枚嗄辏瑥V泛應用于營養補充劑、功能性食品配方成分及藥物成分等方面[1]。花青素是一類黃酮類化合物，由水溶性色素組成，可使花卉、水果、谷物和蔬菜等呈現紅色、藍色和紫色，如葡萄、藍莓、黑加侖、覆盆子、山楂、桑葚、黑豆、黑米、紫薯和紫甘藍等物質中都含有豐富的花青素[2]?；ㄇ嗨氐慕Y構特征性很強，以1個苯環、1個含氧三碳雜環和1個苯環結合而成，是典型的C6—C3—C6骨架結構，其母核結構是2-苯基苯并吡喃陽離子，穩定性較差，在C3，C5和C7位上極易發生羥基取代反應，故在自然界中幾乎不存在游離的花青素，通常情況下與糖結合形成花色苷。花青素種類豐富，對人體健康非常有益，與金屬離子作用機制多樣化，如在調節鐵代謝方面，抑制鐵調素的表達。由于花青素在食品工業中的重要性，了解其提取純化方法，以及與金屬離子的相互作用具有一定意義。

1 食品中主要花青素組成及其功能

1.1 食品原料中花青素的組成

花青素廣泛存在于開花植物（被子植物）的花、果實、莖、葉、根器官的細胞液中，分布在27個科、72個屬的植物中，其在植物中的含量和種類隨著食品類別、品種、季節、氣候等的不同有很大的差別，且通常與糖結合形成花色苷，結合的糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、己糖和半乳糖等?；ㄉ罩械奶擒栈土u基還可以與羧酸及其衍生物發生?；磻?，如草酸、乙酸、丙二酸、蘋果酸、P-對香豆酸、咖啡酸等，酰基化的花色苷穩定性相對較高[3]?；ㄉ慕Y構及其共軛糖苷和酰基的結構、位置和數量決定花青素種類的多樣性，已發現的花青素及其衍生物有600多種。

Willemse等[1]通過MSE、MS/MS分析多種食品原料中的花青素組成，如表1，藍莓和黑豆中花青素主要以花青素-3-O-單糖苷形式存在，且花青素種類繁多，包括錦葵色素、芍藥色素、牽?；ㄉ?、矢車菊素和飛燕草素等；而紅葡萄皮中則含有多種?；苌?，這些化合物分別由相應的花青素與乙醛和丙酮酸等反應形成，這可能與葡萄發酵和葡萄酒陳釀有關。衍生化的花青素極性降低，因此在Hilic中的保留率低于天然花青素。紫甘藍中發現10余種花青素成分，值得注意的是，紫甘藍中花青素種類只有矢車菊素衍生物，區別只在于糖基的數量和?；鶊F的類型和數量，形成了多種不同的矢車菊素-3-二/三葡萄糖苷-5-葡萄糖苷?；Ｊ?。紅心蘿卜中的花青素主要是天竺葵色素-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的?；苌?，主要取代基是-對香豆?；?、-阿魏?；?丙二酰基。婁秋艷[4]利用高效液相色譜-質譜聯用，分析黑米中的花青素組成，主要包括矢車菊素-3, 5-二葡萄糖苷、矢車菊素-飛燕草素-己糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-蕓香糖苷，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷為主要成分，含量約占81.99%。李甘[5]分析紫洋蔥的花青素組成，包括矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3, 5-O-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3, 5-O-二葡萄糖苷。不同的食品原料中花青素組成有很大差別，同一類的食品原料也因為品種及生長環境等條件的影響不盡相同。

表1 5種食品中花青素的組成

1.2 花青素的主要功能活性

花青素屬于生物類黃酮物質，而黃酮物質做主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。花青素本身易氧化，然而容易被氧化的化合物通常是最好的抗氧化劑，這是因為其能夠提供自由電子或氫供反應自由基。據研究，食品原料的抗氧化活性與花青素的含量存在線性相關性且成正比，花青素和花青素糖苷的抗氧化活性高于維生素C和維生素E。王燕等[6]采用FRAP法、ABTS法和DPPH法測定紫鵑茶花青素的抗氧化能力，在研究濃度范圍內，紫鵑茶花青素的總抗氧化能力、清除ABTS+自由基和DPPH自由基的能力均與其濃度呈正相關，且通過對比得出能力均強于VC。童丹等[7]采用DPPH自由基法測定定西地產“黑美人”馬鈴薯中花青素的抗氧化能力，花青素含量越高，DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越強。

花青素優秀的抗氧化能力使其具有抗疲勞衰老、抗腫瘤、抑菌、調節脂肪代謝、糖類代謝和腸道菌群等多種功能，其抗氧化機制主要表現在：減少活性氧積累和清除自由基、減少DNA損傷、激活酶抗氧化系統以及與金屬離子發生作用等[8]。Chen等[9]從黑米中提取的花青素對癌細胞有抗轉移作用，具體表現為對AP-1的DNA結合活性和核轉位有抑制作用，在體內對SKHep-1細胞的生長有抑制作用。膽管癌與麝貓后睪吸蟲感染有關，矢車菊素和飛燕草素糖苷提取物與姜黃結合形成花青素復合物，針對感染麝貓后睪吸蟲的倉鼠進行試驗，結果表明，復合物增加自由基清除能力，降低炎癥，抑制氧化/硝化應激反應，減少肝損傷和導管周圍纖維化[10]。

2 食品中花青素的主要提取和純化方法

2.1 食品中花青素的主要提取方法

溶劑萃取法一直是最常用的一種提取方法，可以從水果、蔬菜等食品原料中提取多種化合物，包括黃酮類化合物?；ㄇ嗨厥菢O性分子，因此提取花青素的溶劑通常包括甲醇、乙醇、醋酸酸化水、鹽酸介質中的乙醇和丙酮水溶液[11]。這些方法意味著需要后續純化以去除同時被提取出的非酚類物質（如糖、有機酸和蛋白質等），如固相萃取法。溶劑的類型、濃度、體積、溫度、提取時間和提取方法等因素對提取率有顯著影響，這些因素的組合和最佳條件的確定非常重要[12]。

在酸化溶劑萃取中，應特別注意避免使用強酸介質，因為?；ㄉ湛赡軙到猓绻?-單苷花青素，糖苷鍵可能會被破壞[13]。為了提取酰基化花青素和3, 5-二甘醇，有必要使用弱酸介質（甲酸或乙酸）避免其水解，當使用弱酸介質時，可能提取出更多不同的花青素[11]。最常用的萃取劑是酸化甲醇或乙醇，酸性甲醇提取最有效，提取能力要優于酸性乙醇，然而，在食品工業中，乙醇和有機酸更可取，因為它們比甲醇和鹽酸的毒性相對小一些；且乙醇提取過程中可以同時除去果膠蛋白和淀粉等雜質。王鳳娟[14]對比去離子水、0.1%鹽酸、甲醇、乙醇、酸性乙醇、酸性甲醇、丙酮對紅菊苣中花青素的提取率，結果表明，紅菊苣花青素提取的最佳溶劑是酸性甲醇，但是考慮到食品安全性問題，試驗最終選擇了酸性乙醇作為后續提取溶劑。浸泡法也被廣泛應用于花青素提取，尤其是葡萄酒行業，將新鮮葡萄進行研磨，使葡萄汁與皮一起浸泡以提取色素[15]。

除了溶劑的選擇，一些輔助方法的使用可以提高花青素提取效率，如超聲波提取法、超臨界CO2提取法、酶法處理提取、微波輔助提取法及組合使用方法等。張詩卿等[16]優化酶-超聲波法提取桑葚中花青素的工藝參數，確定超聲波的最佳提取功率為180 W，纖維素酶的最佳添加量為8 mg/g。曾琳等[17]采用浸提法、超聲波輔助法及微波輔助法提取黑米中的花青素，微波輔助法提取花青素的穩定性最強；而超聲波輔助法提取花青素的效率最高，但穩定性最弱；浸提法提取的花青素穩定性介于二者之間，但提取率最低。楊萍等[18]利用微波輔助和有機溶劑相結合提取黑枸杞中的花青素，確定最佳微波時間116 s、微波功率146 W。超聲波法經常被用于提取芳香物質、多糖、多酚等，在液體中，超聲波會閉合并激發出瞬間強壓力，產生強烈的擾動效應、空化效應等多級效應，增加溶劑的穿透力，使植物細胞受壓破裂，快速融出細胞中所要提取的目標物，有效縮短提取時間。常規浸提法的提取效率相對較低，因其難易打破原料內部結構，僅可提取出淺表的目標物，造成提取不徹底。微波輔助技術有操作簡便，提取速度快，提取效率高和溶劑可循環利用，減少污染物排放量，改善生產環境等特點。

2.2 花青素提取物的主要純化方法

現有提取方法對花青素沒有選擇性，因為所用溶劑在提取出花青素的同時能夠提取大量其他的化合物，如糖、蛋白質或有機酸。因此，有必要實施后續新的純化技術，以分離出要研究的目標花青素。

從上述目的出發，各種各樣的技術被用于花青素的分離純化，從簡單的固相萃取（SPE）和液液萃?。↙LE）到復雜的色譜技術，如高速逆流色譜法（HSCCC）、中壓液相色譜（MPLC）、和高效液相色譜（HPLC）等。SPE通常在含大孔吸附樹脂、C18或交聯葡聚糖（Sephadex）柱子中進行，其中花青素通過其羥基與填料緊密結合，通過添加不同極性的溶劑來實現花青素與其他化合物的分離。大孔吸附樹脂是20世紀60年代以來發展起來的有機高聚物吸附劑，具有很好的吸附性能。由于吸附量大、成本低、效率高、可再生等優點，近年來被廣泛應用于不同類型植物中花青素的富集分離純化。AB-8型大孔吸附樹脂被多方認證為常用最佳吸附樹脂之一，作為弱極性的樹脂，在吸附過程中，AB-8大孔吸附樹脂易和色素形成氫鍵，使它們之間的結合更加牢固[14,19-20]。HSCCC和MPLC用作純化方法，通過高效液相色譜法進行結構分析，LC-MS/MS進行組分結構鑒定，優點是最大限度地減少分離純化時間和流動相溶劑的使用量，效率相對較高，精確度高。高效液相色譜法檢測花青素最常用的檢測器是紫外-可見光檢測器和二極管陣列檢測器。

各種純化技術既可以是獨立存在，同時又是相輔相成的，2種或多種技術相結合達到的效果通常是1+1＞2，可以分離得到更高純度的花青素單體。Zou等[21]運用高速逆流色譜分離從草莓提取物中分離出3種花青素，經鑒定為天竺葵素-3-蘆丁苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，純度分別達到95.6%，96.2%和99.3%。Yao等[22]采用柱層析和高速逆流色譜相結合的方法，從桑樹果實中分離出高純度的花青素單體。使用Amberlite XAD-7HP柱子和80%乙醇（0.1% HCl）純化得到純度為68.6%的花色苷混合物，后采用正丁醇∶甲基叔丁基醚∶乙腈∶水∶三氟乙酸（30∶10∶10∶50∶0.05，V/V）雙相溶劑體系的高速逆流色譜法分離得到飛燕草素-3-O-蕓香苷、矢車菊素-3-O-蕓香苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷3種花青素單體，并通過核磁共振和液相質譜聯用進行鑒定。郭丹妮等[23]將藍莓粗提取先經過葡聚糖凝膠色譜初步分離，得到花青素粗提液，經過高速逆流色譜分離得到純度分別為65.0%和90.0%的2種花青素。Zhang等[24]通過柱層析和半制備HPLC技術相結合，從紫色甘薯中分離出兩種高分子量?；瘑误w花色苷。

3 花青素提取物與金屬離子的相互作用研究

花的顏色的多樣性最初解釋是金屬離子和花色基元黃洋鹽之間形成螯合物的緣故。在金屬-花青素絡合物中，Mg2+與飛燕草苷型花青素絡合可以形成藍色；而對矢車菊素-花青素形成藍色起重要作用的是與Fe3+；繡球花的藍色涉及非黃酮類與Al3+的絡合；桔梗的藍色花瓣也可能是通過分子內和分子間的堆積以及極少量的金屬離子的存在[25]。盡管早期人們對花青素-金屬絡合物在食品工業中的應用研究較少，但是這個相互作用卻為保持顏色的穩定性提供了積極的可行性方案，特別是當所含的金屬對健康無害，甚至是飲食中必需礦物質的一部分。不同的花青素在同一種金屬離子作用下反應不盡相同；同一種花青素在不同金屬離子作用下反應也不相同。金屬離子在水中會分解出酸，使溶液呈酸性，花青素在不同pH條件下呈現不同的顏色，因此金屬離子的加入可以改變花青素的顏色。一些金屬離子的加入，能夠有效提高花色苷的穩定性；也有部分金屬離子可以和花青素發生螯合作用生成螯合物[26]。

一些關于植物顏色穩定性的研究表明，藍色是由于花青素與一些金屬如鋁、鐵、銅和錫之間的絡合作用?；ㄇ嗨卦贐環上如果有臨位羥基（如Cy、Dp、Pt），可以和鐵、鈣、銅、鋁等金屬離子發生絡合反應形成花青素-金屬絡合物。根據此特征，通過向花青素溶液中加入金屬離子，觀察其紫外吸收光譜的變化，可以判斷該類花青素B環是否有臨位羥基。金屬離子的濃度、作用對象和pH環境等的不同，其顏色的保護效果和穩定性也不一樣[27]。篤斯越橘果實花青素提取物在pH 3.0條件下，對Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Al3+均表現了一定的穩定性[28]。Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+對紫甘藍花青素水提液的顏色穩定性沒有產生顯著影響；Al3+對紫甘藍花青素提取液有明顯增色作用；Fe3+能直接使提取液變色；Fe2+、高濃度Cu2+則對紫甘藍花青素有明顯褪色作用[29]；而童丹對馬鈴薯花青素的研究中顯示Mg2+、Ca2+對色素的破壞作用較大[7]。張亦竹等[30]研究發現，一定質量濃度（0.2 g/L）Zn2+的加入有助于提高圓茄子皮花青素的提取率。不同的是，張艷暉等[31]研究發現，Zn2+、Cu2+降低了紫色番茄花青素提取量，Ca2+、Mg2+、Na+、Mn2+、Al3+在提取過程中有保護和提高花青素提取量的作用。

4 結語與展望

近幾年，隨著越來越多種類花青素的發現，其作為天然色素在各種產品中的研究與應用顯著增加?？紤]到此類色素對健康的有益影響，將其納入食品和飲料行業具有重要價值。了解花青素分類、提取純化和鑒定方法，以及與金屬離子的相互作用對于花青素在工業中的應用有重要的理論指導作用。富含花青素的原料的多樣性，花青素本身及衍生物的多樣性，為人們提供更多的研究和探索空間；不斷地優化花青素生產加工工藝，將為著色劑在實驗室和工業生產中控制成本方面提供科學方法；同一種金屬離子對不同食品原料中的花青素的提取率和穩定性有的表現促進作用，也有表現為抑制作用。國內主要研究金屬離子對花青素穩定性的影響，對于其作用機制和原理少有報道。隨著科學技術的發展，天然色素的提取、分離、鑒定和應用在食品工業中會有更大的發展前景。