殼聚糖復合涂膜對冷藏青蝦鹽煮熟制品質的影響

齊懿涵，楊晉一，倪榮，馬曉璐，張振，李丹丹

1. 錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121000）；2. 錦州醫科大學生物信息工程學院（錦州 121000）

青蝦學名日本沼蝦又稱河蝦、草蝦，隸屬長臂蝦科，沼蝦屬，對生活環境適應力強[1]，是我國重要的淡水經濟蝦。因其肉質滑嫩、營養豐富、味道鮮美，已成為眾多淡水蝦中最具發展前途的種類之一。

青蝦生理生化、形態性狀、貯藏保鮮、腐敗機理等方面受到廣泛關注[2-3]。隨著人們生活品質的提升和青蝦銷售量的上漲，其營養品質也逐漸引起人們的廣泛關注。蝦類等水產品的貯藏方式仍以鮮銷和冷凍處理為主。而天然、安全的生物保鮮技術作為一種新興研究領域成為食品行業關注的焦點[4]。生物保鮮劑是利用本身具有的抗菌、抗氧化等特點，對食品發揮保鮮作用從而達到防止腐敗污染的目的[5]。近幾年，生物保鮮技術得到廣泛關注，尤其側重對于殼聚糖、多酚類物質的研究[6]。

蝦的鹽煮加工是深加工開發和生產的基礎[7]。鹽煮熟制加工方式會對水產品的感官品質、食用品質及營養價值均具有影響[8]。很少關于生物保鮮劑涂膜貯藏對熟制樣品品質影響的研究。然而蝦肉中富含大量的蛋白質，蛋白質的降解直接影響蝦肉的變質與新鮮程度[9]。因此，關于蝦類品質的討論，對其蛋白質生理生化特性的研究是必不可少的。為更加客觀地對青蝦食用品質進行量化評定，以冷藏青蝦為研究對象，將其進行殼聚糖復合涂膜貯藏處理并按照傳統家庭鹽煮烹飪方式，分別檢測其可食部分的蛋白質含量、持水性、巰基含量、SDS-聚丙酰胺凝膠電泳及肌肉微觀結構的變化；探究涂膜保鮮貯藏的方式對青蝦在可食用狀態下的營養成分的影響，旨在了解生物保鮮劑使青蝦貨架期延長的同時對食用營養特征的影響，為青蝦的合理開發利用及加工貯藏提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青蝦（大小均勻，一級鮮度，顏色鮮亮，購買于錦州市林西路市場）。

殼聚糖（分子量161.16 kDa，脫乙酰度＞95%，黏度100～200 mPa·s，食品級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；ε-聚賴氨酸（食品級，山東欣鼎生物科技有限公司）；卡拉膠（河南洪鑫食化有限公司）；冰乙酸（國藥集團化學試劑有限公司）；牛血清蛋白、SDS-PAGE電泳凝膠試劑盒、考馬斯亮藍G-250、DTNB、Tris-HCl緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器設備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機（北京大龍儀器裝備有限公司）；BCD-178TMPD冰箱（海爾集團）；Varioskan FlashT酶標儀；SDS-PAGE凝膠電泳儀（美國BIO-RAD）；FD-1B-80冷凍干燥機（上海葉拓實驗儀器有限公司）；S-4800冷場發射掃描電鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

將青蝦洗凈，置于冰水中冷凍致死后隨機分為3組備用，并按照前期研究結果制備涂膜液[10]。涂膜液配比如表1所示。

表1 各組涂膜液的配比

將3組樣品分別放置于A組、B組、C組保鮮劑中浸泡10 min后取出，自然瀝干水分后裝入無菌PE保鮮袋中，放入4±1 ℃的冷藏冰箱內進行貯藏。

1.2.2 鹽煮

將上述樣品洗凈，置于鹽度20%微沸鹽水中，轉至大火鹽煮5 min，取出冷卻并去除蝦殼、蝦頭、蝦線等，留可食部分為備用試驗原料進行相應指標的測定[11]。

1.2.3 肌原纖維蛋白的提取

參照Park等[12]的方法略作修改。取搗碎的蝦肉5 g，加入20 mL PBS緩沖液（10 mmol/L），混合分散均勻。在4 ℃條件下以5 000 r/min離心30 min，棄上清，在沉淀中加入3倍體積冰的NaCl溶液，重復3次，在最后一次離心前將沉淀用4層紗布過濾，去除結締組織，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.2.4 蛋白質鹽溶性測定

參考《蛋白質含量測定-考馬斯亮藍法》進行測定[13]。于酶標儀OD595中進行測定。

1.2.5 蛋白質持水性的測定

參照徐言等[11]的方法。稱取5 g（M1）鹽煮后的各組蝦肉樣品，稱量濾紙質量為M3。將稱重后的濾紙包裹樣品置于離心管中，在4 ℃條件下以4 500 r/min離心15 min，取出后精確稱量離心后濾紙的質量M2，參照式（1）計算持水性。

1.2.6 巰基含量測定

參考Benjakul等方法[14]，取1 mL經1.2.3小節方法提取出的蛋白，加入0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液，取4 mL稀釋液，加入0.4 mL DTNB（10 mmol/L），經40℃水浴25 min，在酶標儀A412nm處測吸光度。SH含量（mol/105g Pro）計算見式（2）。

式中：a為吸光度；b為稀釋倍數；C為分子吸光系數，13 600 L/（mol·cm）；M為待測液濃度。

1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

參照Verrez-bagnis等[15]的方法進行操作。取10 μL蛋白溶液，進行測定。設定電泳條件：濃縮膠過程電流恒定在70 V，分離膠電流恒定在100 V，等待溴酚藍顏色到達底部白色膠條處，停止電泳。將試驗凝膠小心取出，分離膠全部放入染色液中染色2 h，使用脫色液去色，蛋白條帶清晰可見即可。

表2 分離膠和濃縮膠配比表

1.2.8 微觀結構

參照李慢[16]的方法，割取鹽煮后的青蝦肌肉橫截面，浸泡在4 ℃的固定液中過夜。取出將樣品于PBS緩沖液中沖洗15 min，洗滌3次，然后將樣品分別在30%，50%，70%，90%和100%的乙醇溶液洗脫樣品15 min，重復2次。將樣品放入冷凍干燥機中過夜使肌肉脫水，待干燥完成后取出，將樣品放置在噴金涂布機（Eiko IB3，JEOL Ltd.，Tokyo，Japan）中處理5 min，并使用SEM（JSM-6390LV，JEOL Ltd.，Tokyo，Japan）進行測定。

1.2.9 數據處理

利用SPSS和Excel 2013進行分析和繪圖，以P＜0.05計為統計具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 蛋白質鹽溶性的變化

以牛血清蛋白為標準蛋白，以其含量為X軸，吸光度為Y軸，繪制濃度-吸光度標準曲線如圖1所示。冷藏青蝦在不同涂膜處理條件下貯藏0～12 d，并分別進行鹽煮加工后蛋白質鹽溶性的變化情況如圖2所示。

圖1 蛋白質標準曲線圖

圖2 蛋白質鹽溶性變化情況

與新鮮樣品相比，各組在進行鹽煮加工后，蛋白含量均下有顯著下降。貯藏前8 d，各組的差異并不明顯，到8～12 d時各組差異性顯著（P＜0.05）。貯藏第12 d時，A組、B組、C組的蛋白質鹽溶性分別為19.01，15.56和13.92 mg pro/g。與空白組進行比較，可以看出涂膜貯藏的方式對鹽溶性的降低有效，而殼聚糖復合涂膜組的效果更為明顯，對蛋白鹽溶性的下降具有抑制作用。測定肌動球蛋白鹽溶性的變化在一定程度上反映了肉蛋白質的變性程度[17]。鹽煮加熱的高溫環境使蛋白質過度水解，鹽溶性下降[18]。

2.2 蛋白質持水性的測定

持水性反映了肌肉中滲出水分的多少，持水性低表示肌肉滲出水分少，說明肌肉細胞組織的完整性較好[19]。不同涂膜貯藏的冷藏青蝦經鹽煮后對樣品蛋白質持水性的影響如圖3所示，新鮮樣品的鹽溶性蛋白溶出率低，結構完整，因此新鮮組的蝦肉汁液滲出量最少，持水性最好。隨著貯藏時間的延長，蝦肉逐漸腐敗變質，因此滲出的水分也逐漸增多。與空白組比較，在貯藏至第10天時復合組與空白組出現顯著差異（P＜0.05），表明殼聚糖復合涂膜組的蝦肉持水能力最強，第12天僅達13.04%；而空白組的蝦肉持水能力最低，12 d達到17.81%，說明空白組腐敗程度最深，蛋白質結構遭到嚴重破壞，水分滲出最多。同時由于樣品經過鹽煮熟制加工，會提高蛋白質與水的結合能力，使整體的持水性有所提高[20]。

圖3 蛋白質持水性的變化

2.3 巰基含量的測定

不同生物保鮮劑對冷藏青蝦鹽煮后的巰基的含量變化如圖4所示。在不同涂膜處理下貯藏12 d的樣品與新鮮樣品相比巰基含量均有顯著下降（P＜0.05）?？瞻捉M的樣品的巰基含量經過貯藏12 d后從新鮮的8.41 mol/g下降至7.91 mol/g，而殼聚糖復合涂膜和殼聚糖單一涂膜的樣品分別下降至8.32和8.17 mol/g，經差異性分析可得不同涂膜處理對鹽煮青蝦肌動球蛋白巰基含量有顯著影響。并且殼聚糖復合涂膜組巰基含量高于其余組，下降速度最慢。

圖4 貯藏期間蛋白巰基含量變化情況

巰基（-SH）是維持蛋白質結構和保持相對酶活性的重要基團，在生物體內極易發生氧化反應，產生二硫鍵，從而導致體內總巰基含量的下降。熱加工處理會使樣品中的巰基含量降低，這是由于加熱會破壞肌原纖維蛋白的結構，巰基發生轉移，活性巰基增加，甚至發生氧化反應，生成二硫鍵和聚集體，因此巰基的質量摩爾濃度降低[21]。這也是經鹽煮后的樣品巰基含量相對較低的原因。

2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

SDS-PAGE利用不同物質的電荷和分子量不同的特點，將生物大分子進行分離從而達到鑒定蛋白質分子量的目的，這種方式也可用于評估樣品在貯藏過程中的蛋白質變化規律。樣品的分子量大致分布于11～180 kDa。肌原纖維蛋白約占蝦體總蛋白的50%～70%，是蛋白質中的重要組成部分。其中，肌球蛋白（約200 kDa）、肌動蛋白（約45 kDa）、原肌球蛋白（約38 kDa）、肌球蛋白輕鏈（17～23 kDa）均屬于肌原纖維蛋白且在電泳圖譜條帶中清晰可見[22]。

冷藏青蝦在不同涂膜處理條件下貯藏12 d后，將其進行鹽煮加工后的蛋白的凝膠電泳圖譜如圖5所示，相比于新鮮樣品，隨著貯藏時間達到12 d時，另外3組條帶均出現較明顯的變淺情況，寬度縮減；A組、B組的電泳條帶較深，與新鮮樣品更為相似。C組的變化程度更大，肌原纖維蛋白條帶亮度明顯低于新鮮樣品和涂膜組，可能是因為與其他的蛋白相比較，空白組的蛋白更容易發生降解。可以說明，殼聚糖復合組蛋白降解的速度較慢，空白組降解蛋白的速度最快。

圖5 SDS-PAGE圖譜

2.5 微觀結構

冷藏青蝦在不同涂膜處理條件下貯藏12 d后經鹽煮加工肌肉組織的微觀結構如圖6所示，不同組蝦肉的組織結構顯著不同。新鮮樣品的表面松散均勻，排列緊密，無明顯纖維斷裂情況，僅有較少縫隙，整體的肌肉結構比較完整。隨著貯藏時間的延長，在第12天時，復合組與新鮮組結構相似，僅出現少量的顯微斷裂情況。而單獨組與空白組均出現一定程度的小片化。空白組的結構小片化嚴重，出現嚴重的凝聚和交聯現象，肌纖維斷裂明顯?？傮w來說，殼聚糖復合涂膜的作用較強于其他組，能夠在一定程度上抑制結締組織降解，防止肌肉質地軟化。

圖6 鹽煮青蝦肌肉組織掃描電鏡圖

3 結論

以青蝦為研究對象，探究殼聚糖復合涂膜對冷藏青蝦鹽煮加工后肌肉蛋白特性的影響。結果表明：殼聚糖涂膜對青蝦鹽煮后蛋白質鹽溶性、持水性及巰基含量均具有保持作用；電泳圖和微觀結構圖也表明蛋白降解程度的差異。試驗是前人涂膜處理對水產品貯藏期間肌肉蛋白品質變化研究的有效補充和延伸，為蝦類品質控制和蛋白質表征新鮮度提供參考。