紅曲米發酵生產甘蔗果酒及其總酚和抗氧化性測定

鄭美玲，黃結，劉梅芳，李楠

1. 廣西壯族自治區食品藥品檢驗所（南寧 530001）；2. 廣西大學生命科學與技術學院（南寧 530004）

甘蔗中含有大量糖分，可作為微生物生長的碳源，也是人類能量代謝的根源[1]。甘蔗中含鐵元素較多，食用甘蔗能改善人體的缺鐵性貧血[2]。甘蔗中存在多種具有生理活性的化合物，如黃酮類、多酚類、單寧以及多糖，使其具有較強的抵抗突變、抵抗氧化和抵抗炎癥的能力，還能夠降低心腦血管疾病的發生，從而加強人體的免疫系統[3-4]。因此利用甘蔗汁發酵可以生產富含營養物質的保健果酒。

紅曲米，又名紅曲，直接在大米上接種紅曲霉發酵而成[5]。紅曲次級代謝產物之一的天然紅色色素——紅曲色素（MP），有助于防患癌癥、降血壓血脂、控制肥壯及染色的功能，在食品和醫藥行業被大范圍地使用[6]。紅曲中的λ-氨基丁酸（GABA），它是一種能抑制突觸的化學遞質，具有加強記憶力、利于減肥等多種生物活性的功能性氨基酸[7]。紅曲米多用于黃酒、米酒等飲品的釀造，紅曲米應用于果酒釀造鮮有相關報道[8]。

試驗將紅曲米作為發酵菌種應用到甘蔗果酒的釀造，整合紅曲米與甘蔗的營養和保健功能，釀造一款保健值更高的風味甘蔗果酒，為果酒增加新的產品，同時拓寬紅曲米的應用范圍，也為拓寬甘蔗產業發揮重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗汁（廣西壯族自治區甘蔗研究所提供甘蔗，實驗室壓榨取甘蔗清汁）；紅曲米（云南滲泉調味食品有限公司）。

1.1.1 試驗藥品

葡萄糖（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水楊酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；福林酚（分析純，南京化學試劑有限公司）；DPPH標準樣品（分析純，美國Sigma公司）；焦性沒食子酸（分析純，浙江溫州市甌海化工試劑廠）。

1.1.2 試驗儀器與設備

MC0-40酒精計（余姚儀表二廠有限責任公司）；PL303電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Sup-250生化培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；雷磁pHS-3E型pH酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；UVmini-1240紫外可見分光光度計（日本島津公司）；TW12恒溫水浴鍋[優萊博技術（北京）有限公司]；SW-CJ-IBJ單人單面凈化工作臺（蘇州澤化設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗汁的制備

新鮮甘蔗→清洗→壓榨→過濾→甘蔗清汁→發酵備用

1.2.2 酒精度的測定

使用酒精計法[9]。

1.2.3 殘總糖的測定

使用DNS法（3, 5-二硝基水楊酸法）[10]。

葡萄糖標準曲線的繪制：稱取足量的葡萄糖烘干至恒重后，精確稱取50 mg，用少量蒸餾水溶解并定容到50 mL，即可得到1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。取9支試管，分別按照表1操作。

表1 葡萄糖標準曲線的制作 單位：mL

將各管混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，待冷卻到室溫后，向各管中加蒸餾水到25 mL，搖勻后在波長為540 nm處測量吸光度，得到葡萄糖標準曲線數據，如表2所示。

表2 葡萄糖標準曲線數據

如圖1所示，葡萄糖標準曲線回歸方程y=0.579 8x-0.009 3，相關系數為R2=0.993 5，說明吸光度與葡萄糖含量之間的回歸效果較好，可用于樣品中葡萄糖含量的測定。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.2.4 樣品殘總糖含量的測定

發酵樣品總糖轉化還原總糖：取5 mL的發酵液于150 mL錐形瓶中，加入10 mL且濃度6 mol/L的HCl溶液，在60 ℃水浴中30 min，待冷卻后，加入10 mL 6 mol/L的NaOH溶液中和，用蒸餾水定容到100 mL，即為總糖轉化還原糖溶液。取1 mL轉化糖溶液，按表2的方法進行殘總糖含量的測定，經過相關計算后即可得到最終的殘總糖含量。

1.2.5 甘蔗果酒發酵工藝優化的單因素試驗

1.2.5.1 紅曲米添加量的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），分別添加1%，2%，3%，4%和5%的紅曲米，在溫度28 ℃、甘蔗汁初始pH 4.0條件下，發酵6 d后測定殘總糖和酒精度，以確定較佳的紅曲米添加量。

1.2.5.2 發酵起始pH的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），加入3%的紅曲米，甘蔗汁的初始pH調整為3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，在溫度28 ℃條件下發酵6 d后測定殘總糖和酒精度，以確定較佳的甘蔗汁初始pH。

1.2.5.3 發酵溫度的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），加入3%的紅曲米，調整甘蔗汁初始pH為4.0，分別在24，26，28，30和32 ℃溫度下，發酵6 d后測定殘總糖和酒精度，以確定較佳的發酵溫度。

1.2.5.4 發酵時間的確定

甘蔗汁裝液量為60%（V/V），加入5%的紅曲米，甘蔗汁起始pH為4.0，調整溫度28 ℃，分別在發酵3，4，5，6和7 d后，測定殘總糖和酒精度，以確定較佳的發酵時間。

1.2.6 甘蔗果酒發酵工藝優化的正交試驗

基于單因素試驗的結果，以紅曲米添加量（A）、甘蔗汁初始pH（B）、發酵時間（C）為考察因素，采用正交試驗進行發酵工藝的優化，各因素和水平如表3所示。

表3 正交試驗因素和水平的設計

1.2.7 抗氧化性的測定

采用DPPH法[11-12]。

1.2.7.1 DPPH母液的配制

精準稱取5 mg DPPH標準樣品，用少量無水乙醇將其溶解并定容到100 mL，暗光反應30 min，即可得到0.05 g/L的DPPH母液。

1.2.7.2 DPPH自由基清除測定

搖勻后將表4中兩種試劑（對照液及含樣品液）在暗光的室溫條件下靜置30 min，測定其在517 nm處的吸光度。清除率按式（1）計算。

表4 DPPH自由基清除測定

1.2.8 總酚含量的測定

采用福林法[13]測定。

1.2.8.1 沒食子酸標準曲線的建立

精準稱取2 mg沒食子酸標準品，用少量蒸餾水將其溶解并定容到100 mL，即為20 μg/mL沒食子酸標準溶液。取8支試管，分別按照表5操作。

表5 沒食子酸標準曲線的制作 單位：mL

充分混勻并靜置5 min后，加入1.5 mL碳酸鈉溶液（20%），搖勻后加蒸餾水至10 mL，在水浴75 ℃下充分反應10 min，冷卻后在760 nm波長下測其吸光度，得到沒食子酸的標準曲線數據，如表6所示。

表6 沒食子酸標準曲線的數據

如圖2所示，沒食子酸標曲的回歸方程y=0.103x+0.035 4，相關系數R2=0.991 7，說明吸光度與沒食子酸含量之間的回歸效果較好，可用于樣品總酚含量的測定。

圖2 沒食子酸標準曲線

1.2.8.2 樣品中總酚含量的測定

各取1 mL甘蔗汁和甘蔗果酒，按照1.2.8.1的方法進行沒食子酸標準曲線的建立，并經過計算后得到最終的總酚含量。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 紅曲米添加量的確定

紅曲米添加量直接影響到發酵菌種的生長速度及其發酵周期，從而影響發酵產酒量。由圖3可知，酒精度隨紅曲米添加量的增加先增大后減少。當加入3%紅曲米時，酒精度達到最高10.7%vol，殘總糖含量為1.43 g/L。其原因有可能是：紅曲米添加量過少時，微生物生物量低導致甘蔗糖分轉化率低，不利于酒精的產生；紅曲米添加量過量時，發酵液中營養物質大多數被用于紅曲霉菌體的生長需要，導致酒精的生成量少[14]。因此較佳的紅曲米添加量在3%左右。

圖3 紅曲米添加量對酒精度和殘總糖的影響

2.1.2 初始pH的確定

pH會影響微生物的酶活力甚至影響物質通過細胞膜的難易程度，從而影響酒精的產量。由圖4可知，甘蔗汁的初始pH為4.5時，酒精度達到最高14.5%vol，殘糖量為1.046 g/L。初始pH＜4.5時，酒精度隨初始pH的增加而逐漸升高。初始pH＞4.5時，酒精度隨初始pH的增加而逐漸降低。分析其原因：pH太低或太高容易導致酶失活，繼而影響微生物代謝從而導致酒度低[15]。因此較適宜的甘蔗汁初始pH在4.5左右。

圖4 初始pH對酒精度和殘總糖的影響

2.1.3 發酵時間的確定

發酵時間的長短對發酵菌種的生長和代謝能力有影響。由圖5可知，隨著發酵時間的增加，酒精度先增加后保持不變。發酵到達6 d，產酒精度最高15.3%vol，殘糖量為1.65 g/L。分析其原因：發酵時間短，培養基中的營養物質利用不充分，轉化生成的酒精量少；發酵時間過長，培養基中營養物質被消耗完，生成的酒精量保持不變[16]。因此較合適的發酵時間為6 d。

圖5 發酵時間對酒精度和殘總糖的影響

2.1.4 發酵溫度的確定

發酵溫度的高低直接影響到發酵菌種的酶活性以及其生長周期，同時影響發酵溶液中的O2濃度、黏度及滲透壓，進而影響酒精的產量。由圖6可知，隨著發酵溫度的增加，酒精度先增加后降低。在28 ℃發酵溫度下，達到最高的酒精度15.6%vol，殘糖量1.52 g/L。分析其原因：發酵溫度太低，導致微生物生長代謝弱，轉化率低而積累酒精少；溫度過高，導致微生物代謝降低甚至喪失，導致酒精產量低。據報道，發酵溫度高時，發酵菌種的生長周期變短，發酵過程中產酸速度加快，酸度增加，從而導致酒度降低[17]。適宜溫度時，微生物菌株生長代謝旺盛，有利于糖分轉化酒精，因此發酵溫度28 ℃較為適宜。

圖6 發酵溫度對酒精度和殘總糖的影響

2.2 發酵工藝優化正交試驗的結果與分析

根據正交試驗的設計方案，進行發酵，分別測定其酒精度，結果見表7。

表7 正交試驗設計及其結果

結果表明，對酒體酒精度的影響順序為紅曲米添加量＞發酵時間＞甘蔗汁初始pH。最適宜的發酵工藝條件組合為A3B2C1，即紅曲米添加量5%、甘蔗汁起始pH 4.5、發酵時間4 d。以最優組合A3B2C1條件做3次驗證試驗，酒精度為15.6%vol，殘總糖為1.54 g/L。

對正交試驗的結果進行方差分析，結果見表8。結果表明，在選定試驗條件下，紅曲米添加量、甘蔗汁初始pH及發酵時間對酒體酒精度的影響均不顯著（P＞0.05）。但在均不顯著的情況下，紅曲米添加量對酒體酒精度的影響最大。

表8 正交試驗結果的方差分析

2.3 總酚含量測定

試驗結果得到甘蔗汁的總酚含量27.17 mg/mL，而甘蔗果酒總酚含量為29.44 mg/mL。甘蔗果酒的總酚含量略微大于甘蔗汁。其原因應該是紅曲米中菌株生長代謝過程中會產生酚類物質，如沒食子酸、芥子酸、蘆丁等，而乙醇經常用作提取總酚的溶劑[18]。甘蔗汁經過發酵產生的乙醇對總酚有抽提作用。

圖7 總酚含量的比較

2.4 抗氧化性測定

自由電子的存在對人體有害，因為它會從細胞中搶奪電子與之配對，從而導致細胞衰老、死亡，而多酚類物質，如黃酮、單寧、沒食子酸及多糖等，其功能基團可以與這些自由電子進行配對，因而削弱自由基對人體的影響。DPPH含有很多的未配對自由電子，常被用于抗氧化性的測定。由圖8可知，甘蔗汁的抗氧化性為50%，甘蔗果酒的抗氧化性為62.8%。

圖8 抗氧化性的比較

3 結論

結果證明可利用紅曲米發酵甘蔗汁生產出營養價值高的甘蔗果酒，并通過單因素試驗和正交試驗確定甘蔗果酒的最佳發酵條件，同時比較甘蔗汁和甘蔗果酒的總酚含量及抗氧化性。試驗為紅曲米的應用增加一個應用領域，也為甘蔗汁的發酵提供一個可行方法，為營養果酒提供新思路。