響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取蕓豆卵磷脂工藝

石瑞，李雪琴，王明華，史曉晶

忻州師范學(xué)院生物系（忻州 034000）

蕓豆（Phaseolus vulgarisL.），學(xué)名菜豆，俗稱二季豆、四季豆或者刀豆等，原產(chǎn)于中南美洲，是一種可以使用的豆科植物，其重要性僅次于大豆。蕓豆?fàn)I養(yǎng)豐富，含豐富蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及氨基酸，其成分高鉀、高鎂、低鈉，適合心臟病、高血脂及低血鉀癥患者食用[2]。

卵磷脂（lecithin），又稱為蛋黃素，普遍存在于蛋黃、豆科植物和動物腦等資源中，與蛋白質(zhì)、維生素并稱“第三營養(yǎng)素”。卵磷脂的主要營養(yǎng)成分包括磷脂酰膽堿及不飽和脂肪酸等物質(zhì)，對人體的細(xì)胞活化、生存及臟器功能的維持等有重要作用[3]，適宜人群廣泛，在保健方面有相當(dāng)重要的價值。除此之外，進(jìn)入老年時期后補(bǔ)充適量的磷脂對老年性癡呆等癥狀有很好的預(yù)防作用。

卵磷脂的提取生產(chǎn)工藝主要有乙醇萃取法、層柱析法、CO2超臨界萃取法及膜分離法，對超聲輔助提取的研究比較少[4-8]。試驗(yàn)采用超聲波輔助乙醇提取蕓豆中卵磷脂，并使用響應(yīng)面優(yōu)化分析最佳提取工藝，以期為卵磷脂的開發(fā)提供更為廣闊的市場，為研究蕓豆卵磷脂提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白蕓豆（山西市忻州市，試驗(yàn)前帶皮粉碎）；磷酸二氫鉀、無水乙醇、丙酮、鉬酸銨、亞硫酸鈉、對二苯酚（均為國產(chǎn)分析純）。

數(shù)控超聲波清洗器（KQ3200DV）；可見分光光度計（UV-1800，浙江塞德儀器設(shè)備有限公司）；二列八孔智能水浴鍋（HK-27，常州金壇良友儀器有限公司）；密封型手提式粉碎機(jī)（DXF-04C200g，廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司）；電子天平（JA203，深圳市科衡儀器電子有限公司）；低速離心機(jī)（LC-4016，北京卓山電子科技有限公司）。

1.2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的測定

準(zhǔn)確稱取0.439 3 g在100～105 ℃烘至恒重的磷酸二氫鉀，溶于水中后移入1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻，此時1 mL溶液含100 μg磷；移取10 mL此溶液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度混勻，此時的溶液中1 mL含10 μg磷，為磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。按順序分別吸取0，0.5，1，2，3，4和5 mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液于7支10 mL具塞試管中，依次加入2 mL 50 g/L鉬酸銨溶液、1 mL 200 g/L亞硫酸鈉溶液和1 mL對二苯酚溶液，加蒸餾水至刻度線10 mL，靜置30 min后，用0號管在波長660 nm處調(diào)零后測定吸光度，以質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)X，以吸光度A為縱坐標(biāo)Y，繪制得磷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.010 3X+0.000 8，R2=0.999 7，線性關(guān)系良好。

1.3 卵磷脂含量的測定

稱取1 g蕓豆粉末，加入3 mL丙酮除雜后，加入體積分?jǐn)?shù)80%的無水乙醇溶液，料液比1∶3（g/mL），超聲波功率120 W，在40 ℃條件下提取50 min后，冷卻離心5 min（4 000 r/min）后，按1.2小節(jié)的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)660 nm處吸光度測定卵磷脂相對含量。測定方法采用的是改進(jìn)亞硫酸鈉鉬藍(lán)比色法，根據(jù)式（1）計算卵磷脂含量[13]。

式中：X為樣品中卵磷脂的含量，mg/100 g；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得測定液中磷含量，mg；V1為消化液定容總體積，mL；V2為消化液稀釋體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蕓豆卵磷脂得率的影響

精準(zhǔn)稱取5份蕓豆粉末，每份1 g，加入3 mL丙酮除雜后，考察無水乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，80%，85%，90%和95%對卵磷脂得率的影響。

1.4.2 料液比對卵磷脂得率的影響

精確稱5份蕓豆粉末，每份1 g，加入3 mL丙酮除雜后，考察料液比1∶2.0，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5和1∶4.0 g/mL對卵磷脂得率的影響。

1.4.3 超聲時間對卵磷脂得率的影響

精準(zhǔn)稱取5份蕓豆粉末，每份1 g，加入3 mL丙酮除雜后，考察超聲時間30，40，50，60和70 min[15]對卵磷脂得率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲時間（C）3個對蕓豆卵磷脂提取影響顯著的因素，利用Design-Expert 7.1.6軟件Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，以卵磷脂得率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表1）。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)加大，蕓豆卵磷脂得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)變化量呈正相關(guān)。體積分?jǐn)?shù)大于95%時達(dá)到最高。因此，選擇蕓豆卵磷脂提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)95%為宜。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對卵磷脂得率的影響

2.1.2 料液比

由圖2可知，料液比1∶2.0～1∶2.5 g/mL時，蕓豆卵磷脂得率和料液比呈正相關(guān)，料液比1∶2.5 g/mL時，白蕓豆皂苷得率達(dá)到最大值。溶劑用量繼續(xù)增加時得率降低，說明過高和過低的料液比并不能使卵磷脂的得率明顯提高，因此，選擇料液比1∶2.5 g/mL為宜。

圖2 料液比對卵磷脂得率的影響

2.1.3 超聲時間

由圖3可知，超聲時間30～50 min時，蕓豆卵磷脂的得率隨提取時間的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，超聲時間50 min時，蕓豆卵磷脂的得率達(dá)到最大值，之后卵磷脂得率開始下降。分析原因可能是適當(dāng)?shù)某晻r間會有利于卵磷脂分子的溶出，而超聲時間太長會造成卵磷脂構(gòu)型破壞，使得蕓豆中卵磷脂凝集沉淀，從而影響蕓豆卵磷脂的溶出，因此，選擇50 min為優(yōu)化超聲時間的中心條件。

圖3 超聲時間對卵磷脂得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 7.1.6程序進(jìn)行響應(yīng)面分析，進(jìn)行蕓豆卵磷脂提取工藝的優(yōu)化。提取試驗(yàn)設(shè)計因素及水平見表1。Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表2。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析和最小二乘法擬合，以卵磷脂得率Y值作為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和超聲時間（C）為自變量，建立回歸方程：Y=20.430 7+1.013 5B-0.230 9A+0.551 6C-0.143 5B2-1.782 2A2-2.304 2C2-0.145 5AB-0.012 0BC-0.510 2AC，刪除不顯著因素后，方程簡化為Y=20.430 7+1.013 5B-1.782 2A2-2.304 2C2-0.510 2AC。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表3和表4方差分析顯示，蕓豆卵磷脂提取工藝參數(shù)回歸模型的P值＜0.05，達(dá)到顯著水平（P＜0.05），且失擬項P值=0.051＞0.05，不顯著，方程與試驗(yàn)擬合度較好，可用于蕓豆卵磷脂提取的分析與預(yù)測?；貧w方程各項方差分析表明，3個影響因素對蕓豆卵磷脂得率影響的大小順序依次為料液比＞超聲時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間交互項對回歸模型影響顯著。

表3 以得率為響應(yīng)值的回歸方程方差分析及顯著性檢驗(yàn)

表4 方差分析

2.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

響應(yīng)面圖可以直觀地反映出各因素及其交互作用對蕓豆卵磷脂得率的影響[9]。坡度越陡峭且顏色變化越劇烈，說明因素之間交互作用越明顯。圖4顯示，料液比（B）對蕓豆卵磷脂得率的影響顯著。乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和超聲時間（C）對蕓豆卵磷脂得率的影響不顯著，但乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和超聲時間（C）交互作用影響顯著。從響應(yīng)面分析圖可以找到最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的關(guān)系[9]。根據(jù)響應(yīng)面分析得到最佳工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶2.434 35 g/mL，超聲時間51.313 min。蕓豆中卵磷脂得率的理論預(yù)測值為20.932%。

圖4 2個因素交互作用對得率的影響

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面法優(yōu)化分析各因素對蕓豆卵磷脂得率的影響，在乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶2.434 35 g/mL，超聲時間51.313 min條件下理論得率最高，但考慮到實(shí)際操作的局限性，將實(shí)際提取工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶2.4 g/mL，超聲時間51 min。在修正條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，檢測結(jié)果吸光度為0.432。經(jīng)過驗(yàn)證，響應(yīng)面分析的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際值較吻合，誤差在允許范圍內(nèi)，說明采用Box-Behnken組合設(shè)計優(yōu)化得到的蕓豆卵磷脂得率工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝克服正交法不能研究因子與因子之間、因子與響應(yīng)值之間相互關(guān)系缺陷[9]。獲得的微波輔助提取蕓豆卵磷脂的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶2.4 g/mL，超聲時間51 min。在3個提取因素中，對蕓豆卵磷脂影響情況為料液比＞超聲時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。在此優(yōu)化工藝下，蕓豆卵磷脂的得率可達(dá)20.932%。試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助蕓豆卵磷脂的提取工藝，為蕓豆卵磷脂的開發(fā)與利用提供一種簡單、快速的提取方法。