響應(yīng)面法優(yōu)化圣女果水開菲爾發(fā)酵工藝

董鑫鑫，舒國偉，代春吉，萬紅昌，董旭，陳合

1. 陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院（西安 710021）；2. 陜西雅泰乳業(yè)有限公司（咸陽 713701）

水開菲爾粒是由乳桿菌為主，包括醋酸菌和酵母菌在內(nèi)的多種細(xì)菌和真菌共同構(gòu)成的共生菌系之間通過某些細(xì)菌分泌的多糖結(jié)合在一起形成的顆粒[1-2]。關(guān)于其起源最流行的理論是水開菲爾粒是由墨西哥仙人掌的汁液發(fā)酵而成的顆粒[3]。Gulitz等[4]對(duì)德國不同地區(qū)的樣本進(jìn)行研究，結(jié)果顯示乳酸菌科的細(xì)菌數(shù)量最多。乳酸菌在無氧條件下發(fā)酵[5]，醋酸菌、酵母菌可以在果蔬表面形成薄膜，為乳酸菌提供厭氧環(huán)境，有利于乳酸菌的生長[6]。水開菲爾粒在室溫下持續(xù)發(fā)酵1或2 d，可以得到混濁的淺黃色飲料[7]，呈輕碳酸和酸性[7-8]。由水開菲爾粒發(fā)酵糖水、水果汁等得到的飲品被稱為水開菲爾。世界上許多地區(qū)都有用水開菲爾粒制作飲料的習(xí)慣[9]。在南美洲流行一種叫作“Tepache”的飲料，該飲料通過將肉桂、菠蘿和紅糖與水開菲爾粒一起發(fā)酵制成[10]。Randazzo等[9]使用地中海水果如蘋果、葡萄、石榴和蔬菜如胡蘿卜、番茄、洋蔥等加入混合發(fā)酵劑成功生產(chǎn)了所謂的“水開菲爾飲料”。這些飲料在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量益生菌[11]、多糖、有機(jī)酸，具有抑制病原微生物[12]、抗炎[13]、提高免疫力[14]等功效。自然發(fā)酵的水開菲爾具有改善人體胃腸道蠕動(dòng)、增強(qiáng)身體免疫力的作用，在全球范圍廣泛飲用[15]，在歐美國家更為盛行，在我國研究較少，針對(duì)水開菲爾粒研究多限于乳制品[16]。當(dāng)前市場(chǎng)上大多數(shù)發(fā)酵果蔬汁產(chǎn)品選用的發(fā)酵菌種單一、果蔬原料單調(diào)[17]，一定程度上限制了產(chǎn)品的種類和風(fēng)味[18]。

研究對(duì)水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁進(jìn)行優(yōu)化，研究接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)水開菲爾粒發(fā)酵的影響，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)分析，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)Ｐ头治觯O(shè)計(jì)三因素四水平試驗(yàn)，考察各因素之間的交互作用，確定水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁的最佳工藝條件，并對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)及驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圣女果，購于陜西省西安市陜西科技大學(xué)超市；4種水開菲爾粒，由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1C-419實(shí)驗(yàn)室保存，分別購于湖南永州、廣東深圳、遼寧沈陽、山東濟(jì)寧，編號(hào)分別為HY、GS、LS、SJ。

氫氧化鈉（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠）；酚酞（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；鹽酸（分析純，鄭州派尼化學(xué)試劑廠）；紅糖（食品級(jí)，南京甘汁園糖業(yè)有限公司）；番紅花T（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BCD-201E/A電冰箱（海信科龍電器股份有限公司）；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化儀器有限公司）；LE204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；EX20電子顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DT34618移液槍[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司]；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（上海科恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；JS51D-250榨汁機(jī)（廣東美的電器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 水開菲爾?；罨c篩選

活化：配制10%的紅糖水，加熱煮沸至完全溶解，分裝于500 mL玻璃瓶中，冷卻至室溫后，按6%的接種量分別接種4種水開菲爾粒，室溫下培養(yǎng)24 h。

篩選：配制10%的紅糖水，分裝于500 mL的玻璃罐中，將HY、GS、LS、SJ此4種水開菲爾粒分別以6%的接種量置于紅糖水中發(fā)酵24 h，分別在發(fā)酵的第12，第15，第18，第21和第24小時(shí)檢測(cè)樣液的pH和酸度，在第24小時(shí)對(duì)發(fā)酵后的水開菲爾粒進(jìn)行稱重，從而篩選出產(chǎn)酸快且增重多的水開菲爾粒。

1.3.2 pH測(cè)定及濕重測(cè)定

在室溫條件下，使用PHS-3C pH計(jì)直接測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定平行數(shù)據(jù)3次。

1.3.3 濕重測(cè)定

用電子天平上測(cè)量發(fā)酵前后水開菲爾粒的濕重。

1.3.4 酸度測(cè)定

按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》[19]中規(guī)定的方法測(cè)定發(fā)酵圣女果汁飲料的酸度。

1.3.5 發(fā)酵圣女果汁感官評(píng)定

發(fā)酵圣女果汁感官評(píng)定細(xì)則見表1。

表1 感官評(píng)定細(xì)則

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以發(fā)酵圣女果汁pH、酸度和水開菲爾粒增重為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及水開菲爾粒接種量對(duì)水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原則，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間以及水開菲爾粒接種量為自變量，以發(fā)酵圣女果汁的pH、酸度、增重百分比、風(fēng)味為響應(yīng)值，利用Design-Expert. V.8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)Ｐ头治觯O(shè)計(jì)三因素四水平的試驗(yàn)，考察各因素之間的交互作用，確定水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁的最佳工藝條件，并對(duì)最佳發(fā)酵工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)及驗(yàn)證。試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 水開菲爾粒篩選試驗(yàn)結(jié)果

在27 ℃下，用接種量為6%的水開菲爾粒發(fā)酵濃度為10%的紅糖水，分別在培養(yǎng)的第12，第15，第18，第21和第24小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH及酸度，在第24小時(shí)測(cè)定水開菲爾粒濕重。不同水開菲爾粒對(duì)紅糖水發(fā)酵的影響見表3。

由表3可知：發(fā)酵12 h時(shí)，發(fā)酵液pH范圍為4.0～4.2；發(fā)酵24 h時(shí)，4種水開菲爾的pH均低于4，其中水開菲爾粒GS發(fā)酵的紅糖液pH最低（pH 3.83）；發(fā)酵24 h時(shí)，水開菲爾粒GS與LS發(fā)酵的紅糖液酸度最高（9.30 g/L），且水開菲爾粒GS增殖能力更強(qiáng)。綜合考慮水開菲爾粒風(fēng)味，篩選出水開菲爾粒GS進(jìn)行下一步的發(fā)酵試驗(yàn)。

表3 水開菲爾粒發(fā)酵紅糖水試驗(yàn)結(jié)果

2.2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁及結(jié)果分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)發(fā)酵溫度為33 ℃時(shí)，發(fā)酵圣女果汁可達(dá)最大酸度；水開菲爾粒增重比隨著接種量的增大持續(xù)降低，當(dāng)接種量為4%時(shí)，發(fā)酵圣女果汁達(dá)最小pH 3.84，達(dá)最大酸度17.73 g/L；在發(fā)酵的

12～24 h，pH下降的速率最大且可達(dá)到最大增重速率。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵圣女果汁pH、酸度、水開菲爾粒增重比和感官評(píng)定為指標(biāo)，采用Box-Benhnken法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表4的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert. V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到回歸方程：

式中：A為溫度，℃；B為接種量，%；C為發(fā)酵時(shí)間，h。對(duì)所得pH、酸度、增重百分比、感官評(píng)價(jià)的二次回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果分別見表5和表6。

表6 水開菲爾粒增重比及圣女果水開菲爾感官評(píng)價(jià)的方差分析

水開菲爾粒GS發(fā)酵圣女果汁培養(yǎng)條件的優(yōu)化數(shù)學(xué)模型顯示了發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵圣女果汁pH和酸度的交互作用。由表5可知，當(dāng)以pH作為響應(yīng)值時(shí)，回歸方程模型的P值（P＜0.000 1）極顯著，決定系數(shù)R2為98.38%，說明該二次方程可以在超過98.38%的情況下使用，調(diào)整系數(shù)（Radj2）為96.29%，說明實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值有很好的聯(lián)系，證明對(duì)pH的預(yù)測(cè)可行。接種量和發(fā)酵時(shí)間的二次主效應(yīng)顯著（PB2＜0.05，PC2＜0.001），這表明水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁中的變量和pH之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，各因素顯著順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間（C）＞接種量（B）＞溫度（A）。

表5 圣女果水開菲爾pH、酸度的方差分析

以酸度作為響應(yīng)值時(shí)，回歸模型方程的P值極其顯著（P＜0.000 1），表明回歸模型具有極大的意義。決定系數(shù)R2為99.46%，表明該二次方程可應(yīng)用于超過99.46%的實(shí)際情況。接種量和發(fā)酵時(shí)間的二次效應(yīng)明顯（PB2＜0.05，PC2＜0.000 1）。同時(shí)，發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)培養(yǎng)液的酸度有極其顯著的影響（P＜0.001），這表明水開菲爾粒GS發(fā)酵圣女果汁的變量與酸度之間不是簡(jiǎn)單的線性相關(guān)關(guān)系，各因素顯著順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間（C）＞接種量（B）＞發(fā)酵溫度（A）。

根據(jù)表6方差分析結(jié)果可以看出，當(dāng)以水開菲爾粒增重比作為響應(yīng)值時(shí)，回歸方程模型項(xiàng)P值小于0.000 1，表明該模型極其顯著，且水開菲爾粒的接種量對(duì)其影響最顯著。接種量（B）對(duì)水開菲爾粒增重的影響極其顯著（P＜0.000 1）。當(dāng)以發(fā)酵圣女果汁感官評(píng)定作為響應(yīng)值時(shí)，回歸方程模型項(xiàng)P值小于0.01，表明該模型非常顯著。接種量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)發(fā)酵圣女果汁感官評(píng)定的影響非常顯著（PB＜0.01，PC＜0.01）。均無二次項(xiàng)，表明各試驗(yàn)因素對(duì)此二個(gè)響應(yīng)值的影響是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

發(fā)酵溫度、水開菲爾粒接種量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵圣女果汁的pH和酸度有交互影響，對(duì)此三種條件進(jìn)行響應(yīng)面分析，探究它們之間的具體交互規(guī)律。采用二維等高線圖和三維響應(yīng)面圖對(duì)三個(gè)自變量之間的相互作用進(jìn)行直觀的解釋，對(duì)回歸模型獲得的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖1～圖6。

三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖可以直觀地解釋兩個(gè)自變量之間的相互作用。三維響應(yīng)面圖可以指示自變量對(duì)響應(yīng)變量的影響，二維等高線圖可以解釋自變量之間相互作用的顯著性。在響應(yīng)面圖中，對(duì)水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁影響越大的因素，其曲線變化趨勢(shì)越大。在等高線圖中，軸向等高線越密集，說明該因素對(duì)發(fā)酵圣女果汁的影響越顯著。由圖1～圖6可知，pH和酸度這兩個(gè)響應(yīng)因素在相應(yīng)的試驗(yàn)范圍內(nèi)存在響應(yīng)極值，且3組因素的交互作用結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。溫度和接種量酸度影響的等高線圖類似橢圓形，表明溫度和接種量對(duì)酸度的交互作用較強(qiáng)。溫度和接種量對(duì)pH影響的等高線圖接近正圓形，表明此兩種因素對(duì)pH的影響不顯著；接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)pH、酸度影響的3D圖接近馬鞍形，表明此兩個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響不顯著，與方差分析結(jié)果相同。

圖1 溫度和接種量對(duì)pH影響的響應(yīng)面及等高線

圖2 溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)pH影響的響應(yīng)面及等高線

圖3 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)pH影響的響應(yīng)面及等高線

圖4 溫度和接種量對(duì)酸度影響的響應(yīng)面及等高線

圖6 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度影響的響應(yīng)面及等高線

圖5 溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度影響的響應(yīng)面及等高線

2.3 最佳工藝條件試驗(yàn)驗(yàn)證

通過響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析及等高線圖分析，水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度31℃、接種量4.47%、發(fā)酵時(shí)間17.89 h，在此條件下預(yù)測(cè)發(fā)酵圣女果汁pH為3.7，酸度為19.36 g/L，增重比為0.21，感官評(píng)價(jià)為73分。考慮到實(shí)際可操作性，將發(fā)酵條件修正為發(fā)酵溫度31 ℃、接種量4.5%、發(fā)酵時(shí)間18 h，在此條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)。經(jīng)過3組平行試驗(yàn)，最終pH為3.75，酸度為18.40 g/L，增重比為0.20，感官評(píng)價(jià)為78分。與模型預(yù)測(cè)值接近，驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.4 討論

試驗(yàn)使用水開菲爾粒作為發(fā)酵劑，以圣女果汁作為發(fā)酵基質(zhì)，探究其發(fā)酵的最佳工藝條件。圣女果營養(yǎng)豐富[20]，含有硒等多種微量防癌抗癌的物質(zhì)[21]，研究表明，經(jīng)常食用西紅柿制品可預(yù)防和治療多種癌癥和疾病，可抗日曬和延緩衰老，且無副作用[22]。目前已有科研人員使用多種發(fā)酵劑對(duì)圣女果深加工進(jìn)行研究。侯瀟[20]研制出多菌種發(fā)酵圣女果柑桔復(fù)合汁飲料，最佳發(fā)酵溫度為30和40 ℃（分段發(fā)酵），這與試驗(yàn)結(jié)果接近。侯瀟[23]研制的多菌種發(fā)酵冬棗圣女果飲料的最佳發(fā)酵時(shí)間為32 h，與試驗(yàn)結(jié)果差異較大，可能是由于發(fā)酵菌種及發(fā)酵基質(zhì)的不同導(dǎo)致。張開平等[24]用5%的菌種接種量發(fā)酵芒果汁與圣女果汁，制得風(fēng)味良好、口感宜人的乳酸菌發(fā)酵飲料。與普通發(fā)酵菌種相比，水開菲爾粒菌系復(fù)雜，其發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生多種多樣的酶，對(duì)底物的水解作用更強(qiáng)，不僅能夠水解多糖類成分，也可以水解以糖苷形式存在的風(fēng)味前體成分，釋放出誘人的果香，菌系自身也會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜、協(xié)調(diào)的香氣成分，并產(chǎn)生各種具有保健功效的次級(jí)代謝產(chǎn)物，保健作用更強(qiáng)[25]。水開菲爾在俄羅斯、美國和東歐的銷量非常高，但在我國相關(guān)報(bào)道較少。圣女果水開菲爾前景廣闊，作為發(fā)酵劑的水開菲爾粒也值得深入探究。

3 結(jié)論

接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵圣女果汁的pH、酸度和感官評(píng)定有顯著影響，接種量對(duì)水開菲爾粒增重比有極顯著影響。優(yōu)化得到發(fā)酵圣女果汁的最佳條件：發(fā)酵溫度31 ℃、接種量4.5%、發(fā)酵時(shí)間18 h，在此條件下得到的圣女果水開菲爾理化性質(zhì)良好。驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)值無顯著性差異，建立的回歸方程擬合良好，采用響應(yīng)面法優(yōu)化水開菲爾粒發(fā)酵圣女果汁工藝參數(shù)可行。該研究可為功能性圣女果汁發(fā)酵飲料的開發(fā)提供參考，為圣女果汁綜合深加工提供借鑒。