黑果腺肋花楸紅樹莓酵素發(fā)酵工藝及活性研究

尹俊濤，劉艷懷，雷勇，代紹娟，張雪梅

石河子開發(fā)區(qū)神內(nèi)食品有限公司（石河子 832000）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）是一種薔薇科腺肋花楸，屬落葉灌木，產(chǎn)于美國東北部的一種紫黑色漿果，之后被前蘇聯(lián)及歐洲引進(jìn)[1-2]，該樹種具較強(qiáng)的耐寒能力，抗旱性強(qiáng)，適應(yīng)從微堿性到酸性的大多數(shù)土壤[3]。我國的黑果腺肋花楸引種栽培歷史可追溯到20世紀(jì)90年代[4]，如今在遼寧、吉林、黑龍江、新疆等多地均有栽培[5]。其果實(shí)含有豐富的營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，是植物界中最豐富的多酚來源之一[6]，主要包括多酚、原花青素、花青素、類黃酮、胡蘿卜素、維生素、有機(jī)酸和礦物質(zhì)[7-10]，其中花青素和原花青素是迄今為止植物中測(cè)量的最高值[11]。果實(shí)有很高的藥理活性[12]，具有抗氧化[13]、抗癌[14]、抗炎[15]、抑菌、降脂、減少重金屬在體內(nèi)沉積[16]等作用，于2018年被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)為新食品原料[17]，但由于其鮮果口感苦澀，不適宜鮮食[18]，影響其開發(fā)與推廣。

紅樹莓為薔薇科懸鉤子屬多年生植物，其果實(shí)為漿果，富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、鞣花酸、酮類、多酚、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，具有美白、抗衰老、抗腫瘤、降血壓、降血糖等[19-20]作用，色味俱佳，營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“第三代黃金水果”[21-22]。

酵素是以果蔬等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而成的一種功能性物質(zhì)，SOD是重要的生物活性因子。研究發(fā)現(xiàn)，天然酵素具有抗氧化、清除自由基、抗菌、保肝、疏通腸道和血液凈化等作用，受到國內(nèi)外研究人員的極大關(guān)注[23-28]。對(duì)2種或2種以上果蔬復(fù)合的研究是功能性飲料的發(fā)展趨勢(shì)[29]。因此，原料選用黑果腺肋花楸和紅樹莓，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，通過檢測(cè)SOD酶活性含量，對(duì)復(fù)合酵素抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。黑果腺肋花楸紅樹莓復(fù)合酵素的研發(fā)，既豐富酵素品種，又提高營養(yǎng)價(jià)值，滿足消費(fèi)者對(duì)市場(chǎng)的需求。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黑果腺肋花楸（新疆塔城地區(qū)種植采摘）；紅樹莓（新疆伊犁地區(qū)種植采摘）；白砂糖（市售，食品級(jí)）；SOD活性檢測(cè)試劑（Beijing Solarbio Science &Technology Co.，Ltd.）；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；YZ-550型石英亞沸水高純水蒸餾器（江蘇省金壇市白塔石英玻儀廠）；KXB-12A電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海科析試驗(yàn)儀器廠）；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（常州金壇良友儀器有限公司）；打漿機(jī)[飛利浦（中國）投資有限公司]；GL623型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器廠）；PHS-3CT型酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；WYA-2S數(shù)字阿貝折射儀（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合酵素的制備

黑果腺肋花楸、紅樹莓→揀選、去?！逑矗o菌條件下）→瀝干水分→粗打漿破碎→無菌密封罐→加入無菌白砂糖、檸檬→密封罐口→恒溫發(fā)酵→放氣→發(fā)酵后過濾→終止發(fā)酵→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 原料預(yù)處理

挑選果實(shí)飽滿、成熟度好、無霉?fàn)€果，剔除果梗，用高壓滅菌鍋對(duì)試驗(yàn)過程所使用的器具充分滅菌，在無菌條件下，用無菌水清洗果實(shí)，瀝干水分，用打漿機(jī)粗打漿，使果實(shí)破碎，利于營養(yǎng)成分的溶出。

1.3.2.2 復(fù)合酵素制備

將破碎的原料加入無菌密封罐中，一層原料一層白砂糖，罐口用鮮檸檬片及白砂糖封口，對(duì)罐口進(jìn)行殺菌處理，密封罐口，放置在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。前期每2～3 d放氣1次，后期6～7 d放1次氣，待發(fā)酵液無氣泡產(chǎn)生澄清時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，過濾皮渣，即得復(fù)合酵素，紫外光照射3 h終止發(fā)酵，低溫儲(chǔ)存。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 原料配比對(duì)復(fù)合酵素的影響

黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比分別設(shè)定為5∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶5，固定白砂糖用量10%、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵時(shí)間21 d，分別測(cè)定SOD酶活性并進(jìn)行感官評(píng)分，考察原料配比對(duì)復(fù)合酵素的影響。

1.3.3.2 白砂糖用量對(duì)復(fù)合酵素的影響

白砂糖用量分別設(shè)定為4%，6%，8%，10%和12%，固定黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比1∶1、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵時(shí)間21 d，分別測(cè)定SOD酶活性并進(jìn)行感官評(píng)分，考察白砂糖用量對(duì)復(fù)合酵素的影響。

1.3.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合酵素的影響

發(fā)酵溫度分別設(shè)定為20，22，24，26和28 ℃，固定黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比1∶1、白砂糖用量10%、發(fā)酵時(shí)間21 d，分別測(cè)定SOD酶活性并進(jìn)行感官評(píng)分，考察發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合酵素的影響。

1.3.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合酵素的影響

發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為7，14，21，28和35 d，固定黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比1∶1、白砂糖用量10%、發(fā)酵溫度24 ℃，分別測(cè)定SOD酶活性并進(jìn)行感官評(píng)分，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合酵素的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比、白砂糖用量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)合酵素發(fā)酵條件優(yōu)化，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)（見表1），設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)（見表2），確定最佳發(fā)酵條件。

表1 復(fù)合酵素感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 抗氧化活性評(píng)價(jià)

抗氧化活性評(píng)價(jià)采用SOD酶活性含量評(píng)價(jià)，SOD酶活性檢測(cè)方法采用可見分光光度法進(jìn)行，具體操作要點(diǎn)如下。

樣品的前處理：按照組織質(zhì)量（g）∶提取液體積（mL）為1∶5～1∶10，進(jìn)行冰浴勻漿；按8 000g4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至560 nm，用蒸餾水調(diào)零，在EP管（測(cè)定管、對(duì)照管、空白管1、空白管2）中分別加入對(duì)應(yīng)量的樣品及試劑，充分混勻，在37 ℃水浴30 min后，置1 mL玻璃比色皿中測(cè)定560 nm下的吸光度，分別記為A測(cè)定，A對(duì)照，A空1和A空2。

SOD活性=[抑制百分率/（1-抑制百分率）×V反總]/（W×V樣/V樣總）×F=11.4×抑制百分率/（1-抑制百分率）/W×F（4）式中：SOD活性，U/g鮮重；V反總為反應(yīng)體系總體積，1.026 mL；V樣為加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.09 mL；V樣總為加入提取液體積，1 mL；W為樣品質(zhì)量，g；F為樣本稀釋倍數(shù)。

1.4 復(fù)合酵素中各項(xiàng)指標(biāo)分析檢測(cè)

1.4.1 可溶性固形物檢測(cè)

采用阿貝折射儀檢測(cè)，方法參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[30]。

1.4.2 總酸檢測(cè)

采用酸堿滴定，方法參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[31]。

1.4.3 乙醇檢測(cè)

參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原料配比對(duì)復(fù)合酵素的影響

原料質(zhì)量比對(duì)復(fù)合酵素香氣影響較明顯，由圖1可知，黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比在5∶1，2∶1和1∶1時(shí)，復(fù)合酵素感官評(píng)分隨著黑果腺肋花楸的減少而逐漸提高，原料質(zhì)量配比1∶1時(shí)，感官評(píng)分最高。與原料質(zhì)量比5∶1時(shí)（最低值）比較，2∶1，1∶1和1∶2時(shí)復(fù)合酵素感官評(píng)分有明顯變化，說明原料質(zhì)量比是影響復(fù)合酵素口感的關(guān)鍵因素之一，在正交試驗(yàn)中可以選取最高值附近的原料質(zhì)量比（2∶1，1∶1和1∶2）做進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 原料配比對(duì)復(fù)合酵素的影響

2.1.2 白砂糖用量對(duì)復(fù)合酵素的影響

白砂糖用量對(duì)復(fù)合酵素口感有直接影響，由圖2可知，隨著白砂糖用量增加，感官評(píng)分呈上升趨勢(shì)，白砂糖用量10%時(shí)，復(fù)合酵素的感官評(píng)分最高，隨后呈現(xiàn)迅速下降趨勢(shì)?？蛇x取其中評(píng)分較高的白砂糖用量（6%，8%和10%）作正交試驗(yàn)優(yōu)化。

圖2 白砂糖用量對(duì)復(fù)合酵素的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合酵素的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度升高，感官評(píng)分呈逐漸上升再下降趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著環(huán)境溫度升高，發(fā)酵菌絲的活性隨之增加，溫度達(dá)到24 ℃時(shí)為發(fā)酵最佳溫度，溫度繼續(xù)上升則影響發(fā)酵菌絲的生長，感官評(píng)分呈明顯下降趨勢(shì)。與發(fā)酵溫度20 ℃（最低值）相比，22，24和26 ℃時(shí)復(fù)合酵素感官評(píng)分有顯著差異，說明發(fā)酵溫度是影響復(fù)合酵素感官的關(guān)鍵因素之一，可選取最高值出現(xiàn)附近的溫度水平（22，24和26 ℃）作正交試驗(yàn)優(yōu)化。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)合酵素的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合酵素的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，感官評(píng)分呈明顯上升趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間21 d時(shí)，感官評(píng)分最高，隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長，感官評(píng)分緩慢降低，這是由于后期發(fā)酵緩慢，口感無明顯變化?？蛇x取其中評(píng)分較高的時(shí)間水平21，28和35 d作正交試驗(yàn)優(yōu)化。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合酵素的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過正交試驗(yàn)結(jié)果表（表3）中極差R值可知，原料質(zhì)量比對(duì)復(fù)合酵素品質(zhì)有顯著影響，其次為發(fā)酵溫度，各因素主次排列順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，即黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比＞發(fā)酵時(shí)間＞白砂糖用量＞發(fā)酵溫度。由k值可知各因素水平對(duì)結(jié)果影響，因此最佳發(fā)酵條件為A2B3C2D1。即黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比1∶1，白砂糖用量10%，發(fā)酵時(shí)間28 d，發(fā)酵溫度22 ℃。對(duì)上述最佳發(fā)酵條件進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3組，其平均分為90.4分，大于正交試驗(yàn)表中第9組試驗(yàn)組合A3B3C2D1評(píng)分。因此，最佳組合為A2B3C2D1，所得復(fù)合酵素口感清甜，香氣純正。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.3 復(fù)合酵素抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果

酵素因其富含SOD活性而具有較好的保健功效，酵素SOD活性含量的高低通常作為衡量其抗氧化功效的一個(gè)指標(biāo)[32]，將不同發(fā)酵階段樣品按照樣品的前處理，采用可見分光光度法在波長560 nm處檢測(cè)復(fù)合酵素樣品中SOD酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線，如圖5所示。

從圖5可知，發(fā)酵過程中，SOD酶活性隨著發(fā)酵時(shí)間延長呈先升后降趨勢(shì)，發(fā)酵前21 d呈上升趨勢(shì)，第21天其SOD酶活性處于最高狀態(tài)，此時(shí)SOD酶活性為3 876 U/g，復(fù)合酵素抗氧化活性最強(qiáng)，21 d以后緩慢降低，35 d后趨于平穩(wěn)階段。

圖5 發(fā)酵過程中SOD活性變化

2.4 復(fù)合酵素中各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 感官指標(biāo)檢測(cè)

色澤明亮正常呈紫紅色，具有黑果腺肋花楸和紅樹莓應(yīng)有的滋味和氣味，無異味，料液清澈透明，無外來雜質(zhì)。

2.4.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

該復(fù)合酵素中超氧化物歧化酶（SOD）活性為3 876 U/g鮮重，可溶性固形物6.2%，總酸2.67 g/100 g，乙醇含量0.23 g/100 g，符合T/GBTIA 08003—2017《中國生物產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn) 食用植物酵素》等國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)考察原料質(zhì)量比、白砂糖用量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素對(duì)復(fù)合酵素感官評(píng)分的影響，以及通過正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酵素發(fā)酵條件，結(jié)果表明，黑果腺肋花楸與紅樹莓質(zhì)量比1∶1，白砂糖用量10%，發(fā)酵時(shí)間28 d，發(fā)酵溫度22 ℃時(shí)，復(fù)合酵素感官綜合評(píng)分最佳，該復(fù)合酵素口感清甜，具有黑果腺肋花楸和紅樹莓應(yīng)有的果香及發(fā)酵后特有的香氣，色澤為紫紅色，透明無雜質(zhì)，具有一定的抗氧化功效。黑果腺肋花楸紅樹莓復(fù)合酵素的研究不僅豐富酵素產(chǎn)品市場(chǎng)種類多樣化，而且為消費(fèi)者帶來極大的營養(yǎng)價(jià)值與需求，為黑果腺肋花楸、紅樹莓精深加工及酵素產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。