響應面法優化藜麥種子ABA提取工藝

吳鮮，王仕玉，郭鳳根*，陳凡，龍雯虹，劉正杰

1. 云南農業大學 農學與生物技術學院（昆明 650201）；2. 云南農業大學 園林園藝學院（昆明 650201）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld）又叫南美藜等，為莧科藜屬植物，原產于安第斯山脈[1]，種子主要有白、紅、黑3種顏色[2]，富含蛋白質[3]、脂質、礦物質[4]、維生素和纖維[5]等。在過去40年中，從藜麥種子中至少鑒定出193種次生代謝物，它們主要包括酚酸、類黃酮、萜類化合物、類固醇和含氮化合物，這些代謝物表現出許多生理功能，如殺蟲、殺軟體動物、抗菌、抗氧化、細胞毒性、抗糖尿病和抗炎特性[6]。

脫落酸（ABA）是一種具有倍半萜結構的植物激素，在很多植物的休眠中作為一種主要的生長抑制劑而存在，在農業生產上ABA可防止在不利條件下種子過早發芽和幼苗生長。很多植物的種子都可用ABA浸泡而防止發芽，而且它的作用是可逆的，且很容易從已處理過的種子中被淋洗出去，因此可用ABA抑制種子發芽，用于種子儲藏[7-8]。然而，ABA在植物體內的濃度很低，實現超低濃度檢測是ABA應用的關鍵[9]。試驗研究中，HPLC法具有靈敏度和選擇性高、重復性好、分析速度快等特點[10]，被人們廣泛用于植物激素分析。

經過試驗種植，藜麥能很好地適應云南省土地貧瘠、海拔相對高的地區，但由于云南干、濕季分明，藜麥種子成熟時多數地方的雨季尚未結束，穗發芽現象嚴重影響著云南藜麥的產量和品質。此次采用Box-Behnken響應面試驗，以ABA得率作為評價指標，對能夠影響ABA得率的主要因素（甲醇體積分數、提取時間、液料比）進行優化，以獲得最優的工藝參數，為研究云南藜麥資源的穗發芽抗性機理提供技術支撐。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；OSB-2100旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；Allegra 21R臺式高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）；PHS-3C型精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）；CP214型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

ABA標準品（上海源葉生物科技有限公司）；色譜級甲醇（北京邁瑞達科技有限公司）；乙酸乙酯、石油醚（分析純，東光華科技股份有限公司）；試驗用水為超純水。

1.2 樣品前處理

試驗材料參考Tansupo等[11]的處理方法并予以改進和優化，以甲醇為提取溶劑[12-13]。稱取1.00 g液氮冷凍的藜麥種子，磨碎為干粉，加30 mL 80%預冷甲醇，膜密封后避光過夜浸提。在4 ℃條件下，以8 000 r/min離心10 min，收集上層溶液，沉淀加20 mL 80%預冷甲醇，離心10 min，重復2次，將3次收集液合并。所有溶液在40 ℃下濃縮到原體積的1/3，用同體積的石油醚進行脫色3次，去醚相。水相用30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在40 ℃下蒸干，殘留物過Sep-Pak C18小柱純化，濃縮后用甲醇溶解并定容至2 mL，過0.22 μm有機濾膜后進行HPLC分析。

1.3 提取工藝優化

工藝優化試驗均以采集的同一黑藜種子為材料，進行激素的提取和含量測定。

1.3.1 單因素試驗

稱取1.00 g藜麥種子研磨至粉末，在其他條件保持不變的情況下，分別考察甲醇體積分數、提取時間、液料比等因素對ABA得率的影響。

1.3.1.1 甲醇體積分數對ABA得率的影響

稱取1.00 g樣品，甲醇體積分數梯度設置為60%，70%，80%，90%和100%，在浸提時間12 h、液料比10∶1（mL/g）、40 ℃減壓蒸干的條件下，提取液處理后測量ABA得率，以確定較優甲醇體積分數。

1.3.1.2 提取時間對ABA得率的影響

稱取1.00 g樣品，提取時間梯度設置為12，14，16，18和20 h，確定溶劑為80%的乙醇，在液料比30∶1（mL/g）的條件下，提取液處理后測量ABA含量，以確定較優提取時間。

1.3.1.3 液料比對ABA得率的影響

稱取1.00 g樣品，液料比梯度設置為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1（mL/g），確定溶劑為80%的甲醇，在4 ℃避光浸提16 h，提取液處理后測量ABA得率，以確定較優液料比。

1.3.2 響應面試驗

基于單因素優化試驗的結果，采用Design Expert 8.0.6，進行Box-Behnken方法三因素三水平響應面試驗設計，因素與水平設計見表1。根據響應面構建的數據模型確定最優的提取工藝參數。

表1 響應面試驗因素水平設計

1.4 ABA含量的測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent公司），流動相A為甲醇，流動相B為乙酸的水溶液（pH 3.5）。梯度條件：0～6 min，38% A；6～8 min，38% A～45% A；8～11 min，45% A～53% A；11～22 min，53% A～40% A；22～30 min，40% A。流速為1 mL/min，檢測溫度為室溫，進樣量為10 μL，在ABA最大吸收波長254 nm處檢測。

1.4.2 標準溶液的配制

用色譜甲醇配制10，5，2.5，1.25和1 μg/mL梯度標準溶液，按優化色譜條件進行測定，以峰面積（mAU）為縱坐標、標準品質量濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得到方程：y=95.024x-12.832，其決定系數R2=0.999 5，檢出限為0.01 μg/mL，用此方程可以精確計算藜麥種子ABA含量。

1.4.3 穩定性試驗

準確稱取1.00 g藜麥種子，重復6份，按照最優工藝提取，測定樣品里ABA含量，并計算SRSD值，要求該值小于3%。

1.4.4 加標回收率驗證

精密稱取1.00 g藜麥種子，磨成粉末，置于三角瓶中，分別加入2，5和10 μg ABA標準品，重復3次。樣品在上述最優處理參數下進行提取，提取液經HPLC分析，計算其得率及加標回收率。

1.5 數據分析

方差分析（ANOVA）采用IBM SPSS Statistics 24進行Duncan檢驗，P值小于0.05表示數據之間的差異具有統計學意義，使用Design Expert 8.0.6和Oringin 2018進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 甲醇體積分數對ABA含量的影響

ABA含量受甲醇體積分數影響的結果見圖1。當甲醇體積分數處于60%～80%時，ABA含量隨體積分數的增大而提高；當甲醇體積分數大于80%時，ABA含量反而下降，因此，80%為較優的甲醇體積分數，推測原因可能是過高的甲醇體積分數使得ABA的溶出率已趨近飽和，導致ABA含量反而下降的情況出現，黃靖等[16]研究也表明，80%冷甲醇浸提是普遍采用的激素提取方法，有較高的回收率。

圖1 甲醇體積分數對ABA含量的影響

2.1.2 提取時間對ABA含量的影響

ABA含量受提取時間影響的結果如圖2所示。在16 h以前，樣本中ABA含量隨提取時間的增加而增加，并在16 h處達到峰值，而在16 h之后，含量反而會隨時間的增加而下降，推測可能是ABA長期提取導致了降解，使ABA含量降低。由此可見，16 h為較優提取時間。

2.1.3 液料比對ABA含量的影響

ABA含量受液料比影響的結果如圖3所示。隨著溶劑體積的上升，ABA含量逐漸增大，并當溶劑與材料的比值為30∶1（mL/g）時含量達到最高點，隨后溶劑體積上升，ABA含量開始下降，可能的原因是ABA的溶出已達到飽和，溶劑體積的進一步增加，促進了樣品中其他成分的溶出。因此，30∶1（mL/g）是較為優異的液料比。

圖3 液料比對ABA含量的影響

2.2 響應面法優化結果

采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析，將表2中的試驗數據進行多元方程擬合，得到ABA含量（Y）方程：ABA含量=0.60+0.029A+0.014B+0.045C+0.010AB+0.002 5AC-0.017BC-0.094A2-0.089B2-0.067C2。

表2 響應面試驗設計和結果

表3為響應面回歸方程的方差分析結果。由表3可知，回歸模型的F=75.99，P＜0.000 1，差異達到極顯著水平。模型的決定系數R2=0.979 9，調整決定系數Radj2=0.953 7，說明該模型可以應用于解釋95.37%的因變量變化情況，擬合度較高，試驗誤差較小。失擬項P=0.678 1，大于0.05，差異不顯著，說明未知因素對試驗結果的影響較小，表明模型選擇合適，可以應用于藜麥種子ABA的提取分析。回歸方程中一次項A（提取時間）、C（液料比）對ABA含量的影響均達到了極顯著水平（P＜0.01），B（甲醇體積分數）對ABA得率的影響達到了顯著水平（P＜0.05），其中影響主次因素為C＞A＞B。交互項BC（甲醇體積分數與液料比）為顯著水平（P＜0.05）；二次項A2、B2、C2均達到極顯著水平（P＜0.01），其中A2＞B2＞C2。

表3 響應面回歸方程方差分析

在其他試驗因素不變的情況下，考察A、B、C各試驗因素之間的交互項對ABA含量的影響，結果如圖4所示。三維響應面直觀反映了其他因素處于中間水平時，剩余兩個自變量對響應值的交互作用，交互曲面整體呈現一近似拱形曲面，僅曲面縱向跨度較大，二者交互作用顯著[17]。在交互項對含量的影響中，當其他因素保持在零水平時，甲醇體積分數的改變并不能顯著影響提取時間（A與B）對含量的影響，反之也成立；時間的改變也不能顯著影響到液料比（AC）對含量的影響，反之也成立；響應面底部等高線圖若趨于橢圓形則表示兩因素相互作用顯著[18]，從響應面圖中可以看出甲醇體積分數與液料比兩個影響因素的輪廓更傾向于橢圓形，方差分析結果也表明甲醇體積分數與液料比交互作用顯著，而甲醇體積分數與提取時間、液料比交互作用并不明顯。由Design-Expert 8.0.6軟件擬合得到的提取條件為甲醇體積分數80.53%、提取時間16.32 h、液料比36.63∶1（mL/g），ABA含量預測值為0.614 1 μg/g。

圖4 各因素之間交互作用對ABA含量的影響

2.3 優化工藝的驗證

2.3.1 重復性試驗

試驗按上述最優工藝參數進行ABA提取為方便實際操作、數據修正為甲醇體積分數80%、提取時間16 h、液料比37∶1（mL/g）。計算得出ABA平均結果為0.601 μg/g，SRSD=2.13%（＜3%），表明試驗重復性較好。

2.3.2 加標回收率驗證

加標回收率結果顯示，不同濃度的3個樣品加標回收率均達到80%以上，回收率結果和張占暢等[14]結果相近，前處理方法可以滿足ABA的測定分析。

使用響應面試驗優化的最優試驗方案，對藜麥種子ABA含量進行測定，高效液相色譜圖如圖5所示。ABA標準品在16.862 min出峰，供試品在16.825 min出峰。

圖5 ABA的高效液相色譜圖

3 結論

研究在單因素試驗分析的基礎上，通過Box-Behnken設計了響應面試驗，考慮到實際實驗的可操作性，將優化條件修正為甲醇體積分數80%、液料比37∶1（mL/g）、提取時間16 h。在此條件下，所測藜麥試材的ABA含量為0.601 μg/g，與模型預測最大值0.614 μg/g無顯著性差異，說明該提取工藝適于藜麥種子ABA含量的測定。