Design-Expert優化纖維素酶提取一點紅黃酮工藝

陳文，王湘君，陳文婧，陳燕，孫宏元，何鴻源

1. 海南熱帶海洋學院理學院（三亞 572022）；2. 海南熱帶海洋學院水產與生命學院（三亞 572022）

一點紅，頂端處的粉色花蕊，葉的背部呈暗紅色，又名紅背葉等，是菊科一點紅系一年生或多年生草本，分布于中國海南、云南等南方地區，在海南多為冬季生長。一點紅主要含有黃酮類、生物堿類、植物甾醇、脂肪酸等化學成分，具有抗氧化、抗菌等藥理活性[1-2]。總黃酮即黃酮類化合物，具有多種藥理活性，包括抗炎、抑菌、預防心血管疾病等功能[3]，對免疫力增強有很好的藥理效果。近幾年，科學技術呈現一種高墻式的飛躍，對其研究也在逐步深入。廖莉等[4]通過Fenton反應的方法建立起體系模型，探究黃酮提取液的濃度與清除率的關系；陳光孝等[5]在對一點紅抗菌活性研究中確定細菌的代謝途徑影響一點紅黃酮類化合物的抗菌效果；劉文佳等[6]采用大孔樹脂純化一點紅水提物黃酮。大部分一點紅植株細胞壁都由纖維素構成，植物有效成分往往被包裹在細胞壁內，要使有效成分的溶出變得簡易，可通過纖維素酶降解細胞壁的作用[7-11]達到目的，纖維素酶能使細胞壁疏松、降解，黃酮類物質能輕易溶出且不破壞其生物活性，提取效率高。結合多方面因素，試驗采用響應面法結合纖維素酶法提取一點紅黃酮，含量由高效液相色譜法測定，以保證方法的準確性，為研究一點紅提供一種新思路，對后續研究一點紅中黃酮類物質和開發利用一點紅具有現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一點紅全草植株，購于三亞荔枝溝市場；5種黃酮標準品（AR），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（AR），西隴科學股份有限公司；石油醚（AR）、磷酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、亞硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、甲醇（色譜級），均購于山東西亞化學工業有限公司；纖維素酶，河南圣斯德實業有限公司。

高效液相色譜儀[島津LC-2010A HT，島津企業管理（中國）有限公司]；數顯恒溫水浴鍋（HH，廣州市盛藍儀器制造有限公司）；數控超聲波清洗機（KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發器（RE-52，廣州亞榮生化儀器廠）；電子分析天平（CP-210，上海精科天美科學儀器有限公司）；真空冷凍干燥機（LGJ-10，北京松源華興科技發展有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9245A，廣州市盛藍儀器制造有限公司）；循環水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，南京長城科工貿有限公司）；高速臺式離心機（TGL-15B，上海安亭科學儀器廠）；冰箱（BCD-206TS）青島海爾股份有限公司；多功能粉碎機（800C，東莞市方太電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 一點紅的預處理

取一點紅全草植株，除去雜質自然晾干，經烘箱烘干進一步脫去水分，置于中藥粉碎機中粉碎，用0.180 mm孔徑（80目）標準篩過篩取細粉，密封干燥保存，以備試驗使用。

1.2.2 一點紅黃酮的檢測

1.2.2.1 最大吸收波長的測定

用移液槍吸取一定量蘆丁標準溶液（c=1.092 mg/mL）置于25 mL比色管中，吸取1 mL 5% NaNO2溶液加入，搖勻放置5 min；吸取1 mL 10% Al(NO3)3溶液加入，搖勻，放置5 min；吸取10 mL 5% NaOH溶液加入，用60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻放置15 min；以備試驗使用，測其最大最大吸收波長。

1.2.2.2 標準曲線測定

用移液槍精密吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素標準溶液（c=1.092 mg/mL）于6支10 mL試管中，配制成不同濃度葡萄糖溶液，在最大吸收波長下測定其吸光度，以濃度作橫坐標，吸光度作縱坐標繪制蘆丁等5種標準曲線，將試驗得到蘆丁等5種樣品也按此方法測其吸光度，參照標準曲線可算得5種樣品濃度。

1.2.3 HPLC測定總黃酮

1.2.3.1 色譜條件的確定

色譜條件：島津LC-2010A HT型高效液相色譜儀，流動相為V甲醇∶V0.2%磷酸=60∶40，總流速0.6 mL/min；檢測波長選擇360 nm；進樣量10 μL；柱溫箱最低溫度25.0 ℃，最高溫度65.0 ℃；檢測分析時間60 min。

1.2.3.2 進樣前預處理1.2.3.3 流動相

甲醇：準備2瓶500 mL色譜甲醇，使用溶劑過濾器經0.45 μm微孔膜過濾，得到過濾后的甲醇溶液，裝入流動相瓶中，超聲15 min，備用。

0.2%磷酸：用移液槍精密吸取2.353 mL 85%甲醇溶液置于1 000 mL容量瓶，加入屈臣氏水定容，后使用溶劑過濾器過0.45 μm微孔膜，得到過濾后的0.2%磷酸水溶液，裝入流動相瓶中，超聲15 min，備用。

1.2.3.4 標準溶液制備

準確稱取各10 mg蘆丁、槲皮素、山奈酚、木犀草素、芹菜素標準品，用色譜甲醇溶解，分別定容至25 mL容量瓶中，配成0.4 mg/mL溶液，各吸取1 mL混合，制成混合標準樣。放入冰箱避光保存備用。

1.2.3.5 供試樣品溶液制備

準確稱取4.00 g經過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，選用經響應面優化的最佳條件對一點紅黃酮進行提取，使用旋轉蒸發儀進行濃縮并回收溶劑，濃縮后的物料置于真空冷凍干燥機中進行干燥，干燥時間為24 h；精密稱取13.2 mg經干燥后的一點紅黃酮，用甲醇溶解，并定容置于50 mL容量瓶中，所得總黃酮的質量濃度為0.264 mg/mL，進樣品前均使用0.45 μm微孔膜過濾。

1.2.4 纖維素酶法提取樣品黃酮條件

試驗選擇對纖維素酶用量（mg）、酶解溫度（℃）、提取時間（min）、乙醇體積分數（%）、料液比（g/mL）這5個單變量因素進行考察，考察各個因素對一點紅黃酮提取工藝的影響，再從中篩選出4個影響比較大的試驗因素，完成初步的響應面優化工作。使用0.45 μm微孔膜過濾；每組試驗稱取一點紅植株粉末，質量均為2.000 0 g，每組試驗都進行精密度試驗（同一組試驗做3次平行試驗）考察，SRSD均為0.98%以上，符合效能指標。

1.2.4.1 不同纖維素酶用量對黃酮提取率的影響

準確稱取2.000 0 g經過篩的一點紅粉末于250 mL錐形瓶中，設定提取時間90 min、酶解溫度50 ℃，按料液比1∶20 g/mL加入體積分數60%乙醇，提取時，酶用量分別為6，16，26，36和46 mg，分析其結果得以確定最佳纖維素酶用量。

1.2.4.2 不同提取時間對黃酮提取率的影響

準確稱取2.000 0 g經過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，固定稱取16 mg纖維素酶酶用量，設定酶解溫度50 ℃，按料液比1∶20 g/mL加入體積分數60%乙醇，提取時，提取時間分別為30，60，90，120，150和180 min，分析其結果得以確定最佳提取時間。

1.2.4.3 不同料液比對黃酮提取率的影響

準確稱取2.000 0 g經過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，固定稱取16 mg纖維素酶用量，設定提取時間90 min、酶解溫度50 ℃，加入體積分數60%乙醇，提取時，料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL，分析其結果得以確定最佳料液比。

1.2.4.4 不同酶解溫度對黃酮提取率的影響

準確稱取2.000 0 g經過篩的一點紅粉末于250 mL的錐形瓶中，固定纖維素酶酶用量16 mg，設定提取時間90 min，按料液比1∶20 g/mL加入體積分數60%乙醇，提取時，酶解溫度分別為40，45，50，55，60和65 ℃，分析其結果得以確定最佳酶解溫度。

1.2.4.5 不同乙醇體積分數對黃酮提取率的影響

準確稱取2.000 0 g經過篩的一點紅粉末于250 mL錐形瓶中，設定纖維素酶酶用量16 mg、提取時間90 min、酶解溫度50 ℃，提取時，料液比1∶20 g/mL，乙醇體積分數分別為30%，40%，50%，60%，70%和80%，分析其結果得以確定最佳乙醇體積分數。

1.2.5 樣品黃酮提取率的測定

稱取2.000 0 g一點紅全草植株粉末置于250 mL錐形瓶中，添加適量乙醇、適量纖維素酶，置于水浴鍋內升至所需溫度，保持恒溫及一定時間對一點紅黃酮進行提取，在90 ℃以上沸水浴上滅酶10 min，趁熱抽濾，棄去濾渣，再經過高速離心機進一步除去濾渣，離心速度6 000 r/min，離心10 min，取上清液在505 nm波長處測吸光度，代入標準曲線方程計算黃酮提取率[12-14]。

式中：C為黃酮質量濃度，mg/mL；V為樣品稀釋溶液體積，mL；n為稀釋倍數；m為一點紅粉末質量，g。

1.2.6 Box-Behnken中心組合試驗設計

為進一步優化試驗樣品處理的最佳條件、提高試驗的提取率，根據單變量因素考察結果，以一點紅總黃酮提取率為指標，選取對黃酮提取量影響最大及穩定性較弱的4個單因素，采用Design-Expert. V8.0.6.1分析軟件進行試驗設計，根據Box-Behnken中心組合設計原理[15-16]，建立四因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗，以黃酮提取率為響應值，選取對試驗結果影響較大的樣品處理條件，選定對提取率影響較大的酶用量（A）、提取時間（B）、酶解溫度（C）和乙醇體積分數（D）作為試驗考察因素，3個水平則根據4個單變量因素試驗結果所確定，各因素的3個水平采用-1，0和1進行編碼，每個水平都是由單因素變量考察，以確定最優提取工藝條件[17-18]，如表1所示。

表1 響應面試驗的因素及水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

精密吸取1 mL經處理的混合標準樣，在最大吸收波長505 nm處，按設定的色譜條件分別進樣4，6，8，10和12 μL，從而得到5種黃酮標準品，即蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素的峰面積；以質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，運用Excel軟件作曲線圖并得出曲線方程，分析結果見表2，回歸直線對測定值的擬合程度好，標準曲線可用。

表2 黃酮5種標準液曲線及相關系數

2.2 纖維素酶用量對黃酮提取率的影響

如圖1所示，控制其他條件不變，只改變纖維素酶用量，一點紅黃酮提取率隨著纖維素酶用量增加，開始時曲線呈現升高趨勢，酶用量16 mg時提取率最大，隨后逐漸下降。原因可能是：纖維素酶能使一點紅植物細胞壁疏松、降解，使黃酮能輕易溶出，提取率增大，但當繼續增加纖維素酶用量時，過多的纖維素酶會包裹在一點紅表面，使黃酮溶出變困難，故提取率降低。因此選擇16 mg為最佳纖維素酶酶用量。

圖1 酶用量對一點紅黃酮提取率的影響

2.3 提取時間對黃酮提取率的影響

如圖2所示，控制其他條件不變，只改變反應提取時間，一點紅黃酮提取率隨著提取時間延長，開始時曲線呈現升高趨勢，在達到90 min后繼續延長提取時間則呈現緩慢下降。原因可能是：剛開始時提取時間較短，酶的降解作用還沒產生效果，黃酮類物質還沒有溶出或溶出較少，測得提取率較低，但隨著時間增加，提取率飆升很快，但繼續增加提取時間，黃酮類物質有部分分解，使一點紅黃酮提取率緩慢降低。因此選擇90 min為最佳提取時間。

圖2 提取時間對一點紅黃酮提取率的影響

2.4 料液比對黃酮提取率的影響

由圖3可知，控制其他條件不變，只改變料液比，一點紅黃酮提取率隨著液體比例增加，開始時曲線呈現升高趨勢，料液比1∶20 g/mL時提取率最大，隨著液體比例繼續增加，提取率變化不大，有略微降低。原因可能是：在合適的料液比下，溶劑與物料一點紅混合得更加充分均勻，使提取率增大，但液體比例過大時，其他物質的溶出影響黃酮類物質檢測，從而使一點紅黃酮提取率下降。因此選擇1∶20 g/mL為最佳料液比。

圖3 料液比對一點紅黃酮提取率的影響

2.5 酶解溫度對黃酮提取率的影響

由圖4可知，保持其他條件不變，一點紅黃酮提取率隨著酶解溫度增加，開始時曲線先呈現升高趨勢，在酶解溫度50 ℃時提取率出現頂峰，后隨著溫度的增加提取率反而下降。原因可能是：溫度過低時，纖維素酶的活性不大，不能對細胞壁起到很好的降解作用，隨著溫度的增加，酶活性被激活，提取率逐漸上升，但繼續提升溫度，過高溫度會導致酶失活，酶發揮不出原有的作用，使一點紅黃酮提取率降低。因此選擇50 ℃為最佳酶解溫度。

圖4 酶解溫度對一點紅黃酮提取率的影響

2.6 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響

由圖5可知，保持其他條件不變，一點紅黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增加，開始時曲線呈現上升趨勢，乙醇體積分數50%時提取率最大，隨著乙醇體積分數增加，提取率不增反降。原因可能是：乙醇體積分數過低時，不能很好地溶出一點紅中黃酮類物質，致使提取率不大，增加乙醇體積分數至50%提取率最大，說明一點紅提取黃酮在這個范圍下最佳，繼續增加乙醇體積分數會導致其他色素或除黃酮類以外的物質溶出，從而影響黃酮提取率，導致提取率降低。因此選擇50%為最佳乙醇體積分數。

圖5 乙醇體積分數對一點紅黃酮提取率的影響

2.7 響應面法優化一點紅黃酮提取工藝

2.7.1 Box-Behnken試驗設計及其結果

2.7.1.1 響應面試驗回歸方程擬合

通過單變量因素的考察，試驗確定以纖維素酶用量、酶解溫度、提取時間和乙醇體積分數為自變量，一點紅黃酮提取率為因變量，根據Box-Behnken中心組合設計原理，通過Design-Expert V8.0.6.1軟件設計四因素三水平組合試驗，進行29組提取試驗。設計結果如表3所示。

表3 Box-Behnken響應面分析試驗設計及結果

2.7.1.2 響應面試驗優化分析

依據回歸模型的分析，經過Design-Expert V8.0.6.1軟件對纖維素酶用量、酶解溫度、提取時間和乙醇體積分數4個因素進行分析，得到對應的等高線圖及響應曲面圖，如圖6～圖11所示，可以直觀反映各因素對一點紅黃酮提取率影響。

圖6 酶用量與提取時間作用對提取率影響的響應曲面及等高線

圖11 酶解溫度與乙醇體積分數作用對提取率影響的響應曲面及等高線

響應曲面表明，提取時間在60～120 min之間，纖維素酶用量在6～26 mg之間，提取率呈現先升后降趨勢，圖形呈凸面狀，從圖形的陡峭程度來看時間后半段的交互影響沒有前半段的影響大，這與單因素的影響結果一致。等高線圖形趨于圓形，反映提取時間和酶用量交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

響應曲面表明，酶用量在6～26 mg之間，乙醇體積分數在40%～60%之間，提取率呈現先升后降趨勢，圖形呈凸面狀，從圖形陡峭程度來看交互影響的結果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映酶用量與乙醇體積分數交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

圖7 酶用量與乙醇體積分數作用對提取率影響的響應曲面及等高線

響應曲面表明，酶用量在6～26 mg之間，酶解溫度在45～55 ℃之間，提取率呈現出先升后降的趨勢，圖形呈凸面狀。從圖形的陡峭程度來看酶用量的影響較乙醇體積分數的大，與方差分析的結果一致。等高線圖形趨于圓形，反映酶用量和酶解溫度交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

響應曲面表明，提取時間在60～120 min之間，酶解溫度在45～55 ℃之間，提取率呈現先升后降趨勢，與單因素結果一致，圖形呈凸面狀，從圖形陡峭程度來看交互影響的結果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映提取時間與酶解溫度交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

圖8 酶用量與酶解溫度作用對提取率影響的響應曲面及等高線

圖9 提取時間與酶解溫度作用對提取率影響的響應曲面及等高線

響應曲面表明，提取時間在60～120 min之間，乙醇體積分數在40%～60%之間，提取率呈現先升后降趨勢，與單因素結果一致，圖形呈凸面狀，從圖形的陡峭程度來看交互影響的結果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映提取時間與乙醇體積分數交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小。

圖10 提取時間與乙醇體積分數作用對提取率影響的響應曲面及等高線

響應曲面表明，乙醇體積分數在40%～60%之間，酶解溫度在45～55 ℃之間，提取率呈現出先升后降的趨勢，與單因素結果一致，從圖形陡峭程度來看交互影響結果明顯。等高線圖形趨于圓形，反映酶解溫度與乙醇體積分數交互作用不顯著，提取率由中心向外逐漸減小，中心提取率最大。

2.7.1.3 方差分析

采用Design-Expert. V8.0.6.1軟件對表3數據進行多元回歸擬合及方差分析，經擬合后得到以一點紅黃酮提取率為目標的函數，關于各因素即酶用量（A）、提取時間（B）、酶解溫度（C）、乙醇體積分數（D）為編碼值的二次回歸方程為提取率=2.84+0.05A-0.02B-0.044C-0.041D-0.095AB+0.023AC-0.043AD+0.038BC+0.033BD-0.073CD-0.268A2-0.278B2-0.367C2-0.272D2。所得的方差分析如表4所示。

由表4所示，獲得回歸方程模型P=0.000 1（P＜0.01），說明該模型具有極顯著的顯著性，即一點紅黃酮提取率與各因素之間的影響顯著，回歸方程模型在統計學上具有意義，模型一次項A（P=0.088 5）、B（P=0.952 2）、C（P=0.128 1）、D（P=0.157 1）為差異不顯著項。從顯著性的結果即P值大小可以表明，4個單變量因素影響順序為纖維素酶用量（A）＞酶解溫度（C）＞乙醇體積分數（D）＞提取時間（B）。交互項中AB（P=0.064 3）、AC（P=0.641 7）、AD（P=0.384 1）、BC（P=0.441 2）、BD（P=0.503 3）、CD（P=0.147 6）為差異不顯著項。在二次項中A2（P=0.000 1）、B2（P=0.000 1）、C2（P=0.000 1）、D2（P=0.000 1）為極顯著項。R2=0.929 6，可以認為有92.96%的響應值變化，數據擬合程度較好。根據Design-Expert V8.0.6.1軟件分析，得出一點紅黃酮最佳提取條件：纖維素酶用量17.02 mg，提取時間89.14 min，酶解溫度49.7 ℃，乙醇體積分數49.21%，得出的預期試驗提取率為2.85%。按照優化的條件進行工藝驗證試驗，進行6次平行測定，由測定結果，計算出相對標準偏差。相對標準偏差（SRSD）是標準偏差（SSD）與平均值的比值再乘以百分之百，即SRSD=（SSD/平均值）×100%[19-20]，6次平行測定的結果為2.84%，2.88%，2.86%，2.83%，2.84%和2.88%，相對標準偏差為0.76%，重復性的結果可靠，且6次測定的結果與預期結果相差不大，該優化工藝可靠，具有真實性。

表4 回歸模型的方差分析及顯著性分析結果

2.8 HPLC試驗結果與分析

2.8.1 液相圖譜分析

由圖12分析，蘆丁的保留時間為7.356 0 min，槲皮素的保留時間為14.889 0 min，木犀草素保留時間為17.583 0 min，山萘酚的保留時間為23.487 0 min，芹菜素的保留時間為25.579 0 min。

圖12 5種黃酮混合標準品色譜圖

2.8.2 黃酮含量的分析

將一點紅樣品在高效液相測出來的各黃酮含量所對應的峰面積（3次平行測定取平均值）代入所對應的黃酮標準液的線性方程之中，結果顯示，蘆丁、槲皮素、山萘酚含量分別為0.144，0.022和0.146 mg/g。樣品的色譜圖及計算結果見圖13和表5。

表5 一點紅黃酮含量計算結果

圖13 一點紅樣品色譜圖

由圖13分析，蘆丁的出峰時間為7.356 0 min，槲皮素的出峰時間為14.889 0 min，山萘酚的出峰時間為23.487 0 min，與標準品圖譜相對應。

3 結論與討論

試驗以三亞荔枝溝市場采購一點紅全草植株為研究對象，經單因素考察，再通過響應面試驗優化設計提取條件，確定纖維素酶提取一點紅黃酮的最佳試驗條件，采用HPLC法測定一點紅中黃酮含量。對單變量因素考察發現：纖維素酶用量16 mg、酶解溫度50 ℃、料液比1∶20 g/mL、提取時間90 min、乙醇體積分數50%為最佳條件；選取其中4個影響較大的因素進行響應面試驗優化，一點紅黃酮最佳提取條件為纖維素酶用17.02 mg、提取時間89.14 min、酶解溫度49.7 ℃、乙醇體積分數49.21%，預期試驗提取率為2.85%。高效液相色譜條件為流動相V甲醇∶V0.2%磷酸=60∶40、總流速0.6 mL/min、檢測波長360 nm、進樣量10 μL、柱溫箱最低溫度25.0 ℃、最高溫度65.0℃、進樣檢測分析時間60 min。采用HPLC測一點紅黃酮含量，對照標準樣的色譜圖和樣品色譜圖，可以看出分離結果較好，可以明顯觀察到蘆丁、槲皮素、山萘酚峰值出現，樣品中蘆丁、槲皮素、山萘酚的含量分別為0.144，0.022和0.146 mg/g，木犀草素和芹菜素未檢出。方差分析發現纖維素酶用量是影響黃酮提取率關鍵因素，優化工藝可靠，具有真實性。試驗方案條件溫和，能保全黃酮活性不被破壞，具備對黃酮活性后續試驗連續性、可操作性及數據有效性。該方法不僅能夠提高提取率，同時減少操作成本，操作簡便，提取結果令人滿意。