下呼吸道感染病原體檢測方法及相關(guān)病原體研究

任燕飛 張 敏 楊 濤 李榮凱 梁 新

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第五臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院檢驗科，河南新鄉(xiāng) 453000；3.新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，河南新鄉(xiāng) 453000；4.新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南新鄉(xiāng) 453000

下呼吸道感染包括支氣管炎、肺部感染、支氣管擴張合并感染、慢性阻塞性肺疾病等，引起下呼吸道感染的主要病原體有肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、支原體、衣原體、病毒等。免疫功能下降、患有其他系統(tǒng)疾病、環(huán)境變化、生活習(xí)慣等因素均對下呼吸道感染病原體有一定影響。選擇合適的病原體檢測方法對下呼吸道感染的進展及預(yù)后至關(guān)重要。本文對近年來病原體的常見檢測方法及相關(guān)病原體流行情況進行綜述，以期為臨床選擇合適的診斷方法提供幫助。

1 下呼吸道感染病原體檢測的常見方法

1.1 病原菌培養(yǎng)法

一直以來，病原菌培養(yǎng)法作為感染性疾病的診斷標準，在疾病病原體診斷及藥敏試驗中發(fā)揮重要作用。該方法主要有以下作用：①對感染病原體做準確的檢驗。②對病原體耐藥性進行試驗。③與臨床關(guān)系緊密，參與臨床感染性疾病的探討。④參與臨床合理應(yīng)用抗菌藥物的管理。該方法的不足之處在于結(jié)果可受多種因素的影響，包括標本的收集過程、送檢時間、接種過程的規(guī)范性、培養(yǎng)條件等因素。在臨床工作中，有時需要多次取樣送檢才能檢出陽性病原體。很難對疾病的早診斷、早治療提供快速精準的檢測結(jié)果。

1.2 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定、膠體金法、補體結(jié)合試驗、間接免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等。其中，酶聯(lián)免疫吸附測定雙抗夾心法廣泛應(yīng)用于下呼吸道感染病原體的檢測，具有特異性強、敏感度高、快速等特點。病原體入侵機體后刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，由于免疫反應(yīng)發(fā)生的延遲，抗體的檢測并不及時。而在免疫力較低下的患者中，例如軍團菌感染、弓形蟲感染的血清學(xué)檢查假陰性的發(fā)生率較高。在臨床中往往不能依靠單一的血清學(xué)抗體來確診某種病原體的感染。在一些特殊情況下（如對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥），血清學(xué)試驗不能作為唯一診斷性試驗，需將血清免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M 與聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法或培養(yǎng)法聯(lián)合以增加檢測的敏感度。除了檢測相關(guān)病原體的抗原或抗體外，降鈣素原（procalcitonin，PCT）和 C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）是臨床實踐中最常用的生物學(xué)標志物。但CRP 的特異性較低，在入住重癥監(jiān)護病房的患者中，CRP 對細菌性肺炎的診斷能力較低。一項Meta 分析顯示，PCT 水平對區(qū)分細菌性和病毒性肺炎具有良好的敏感度，當病毒性肺炎繼發(fā)細菌感染時，特異性為64%，PCT 區(qū)分病毒性和細菌性肺炎的鑒別能力優(yōu)于CRP。

1.3 病原微生物的分子檢測

下呼吸道感染病原學(xué)研究報告顯示，應(yīng)用傳統(tǒng)診斷技術(shù)（微生物培養(yǎng)、血清抗體檢測技術(shù)）對肺部感染患者病原體的檢出率只有38%。21世紀以來，分子診斷領(lǐng)域成為研究熱點，分子診斷技術(shù)不斷提升下呼吸道感染病原體檢測的特異性和敏感度。分子診斷是通過PCR 對病原體特定DNA 片段進行擴增，從而對病原體進行定量和定性診斷的技術(shù)。Gadsby等建立了利用多重熒光PCR檢測多種病原體的方法，通過對249 例陽性樣本的檢測證實該方法的有效性。多重熒光PCR 比傳統(tǒng)培養(yǎng)和血清學(xué)檢查敏感度更高，但也導(dǎo)致難以避免的假陽性結(jié)果。反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)是將一條RNA 鏈逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR 進行DNA 擴增，在病毒檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但該方法不僅需要復(fù)雜的檢測儀器、繁瑣的檢測步驟，還有嚴格的技術(shù)要求，且該方法極易產(chǎn)生實驗室交叉污染，因此，很難大規(guī)模應(yīng)用，尤其是基層醫(yī)院。

1.4 質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜分析技術(shù)比傳統(tǒng)檢驗方法擁有更高的敏感度、檢測更精準。蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)是通過分析細胞中某些特定蛋白質(zhì)的性質(zhì)來評估疾病發(fā)生及演變過程。特別是當細胞內(nèi)出現(xiàn)特異性較高的蛋白質(zhì)時，可以直接做出相關(guān)診斷。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，極大地縮短檢測時間。其中飛行時間質(zhì)譜涵蓋1000 多種菌種數(shù)據(jù)庫，在對傳統(tǒng)檢測較困難的奴卡菌、厭氧菌、放線菌等檢測上作用更加突出。

1.5 16SrDNA 測序

16SrDNA 測序針對病原體細胞核糖體16SrDNA亞基，該基團是細胞進化和分類過程中產(chǎn)生的特異性生物學(xué)標志，并具有高度保守性，這使得該基團成為微生物鑒定的重要結(jié)構(gòu)。該方法除應(yīng)用于細菌鑒定外，還可對病原體菌落及構(gòu)成比進行分析。16SrDNA 測序技術(shù)不依賴于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)，但結(jié)果的準確性遠高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，且能夠提高病原體數(shù)據(jù)的豐富性，在很大程度上提高下呼吸道感染病原體的檢測能力。該方法的應(yīng)用同樣需要嚴格的實驗室流程和規(guī)范操作，才能保證診斷上的準確度。

1.6 恒溫擴增芯片技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是通過一系列特殊設(shè)計的DNA引物，加上高活性的聚合酶，對靶向DNA 鏈進行擴增。在該反應(yīng)體系中，基因擴增通過DNA 鏈上的延伸反應(yīng)的復(fù)制進行（即從3＇端-5＇端的循環(huán)延伸）。隨后在高活性鏈置換DNA 聚合酶作用下使鏈置換DNA 合成不斷循環(huán)，形成一種頸環(huán)結(jié)構(gòu)。其可在65℃恒溫體系下進一步擴增，故不需要調(diào)整反應(yīng)溫度即可完成核酸擴增，從而簡化反應(yīng)過程、提高檢測效率。LAMP 可將不同病原體的DNA 固定在一張芯片中，且攜帶方便，避免對大型檢測設(shè)備的依賴，同時該技術(shù)能一次性完成12 種病原體和1 種耐藥基因的檢測，且避免實驗污染的風險。該方法只需要1 種酶即可在恒定溫度下完成擴增。內(nèi)引物的基本特征為擴增提供了遠高于其他方法的特異性。LAMP 反應(yīng)時間短，在1h 內(nèi)即可完成擴增過程，從標本處理到報告結(jié)果僅需2h，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，可極大地縮短檢測時間。該方法操作簡便且對實驗室的要求較低，可在一般分子實驗室進行。正是由于LAMP 的高靈敏度、高特異性、快速、準確等特點，逐漸成為分子診斷實驗室重要的診斷工具。

2 常見病原體概述

2.1 耐碳青霉烯類腸桿菌科病原體

2017 年世界衛(wèi)生組織發(fā)布一份抗生素耐藥菌的清單。在該份清單中，耐碳青霉烯類和第三代頭孢菌素的腸桿菌科是引起嚴重感染的常見病原體。隨著碳青霉烯類抗生素作為腸桿菌科病原體感染治療的一線用藥被廣泛使用，耐碳青霉烯類腸桿菌越來越多，且表現(xiàn)為多重耐藥。耐碳青霉烯類腸桿菌的耐藥機制主要為：①碳青霉烯類水解酶的產(chǎn)生，能夠水解碳青霉烯類抗生素。②該類耐藥菌膜蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細胞膜通透性降低，使細胞內(nèi)的抗生素濃度大大降低。③細胞膜藥物結(jié)合青霉素蛋白數(shù)量改變，從而細胞膜對碳青霉烯類抗生素的結(jié)合能力減弱。耐碳青霉烯類腸桿菌感染患者病程長、臨床癥狀重，需要更長的治療時間。對患有基礎(chǔ)疾病或年齡較大的患者，往往會引發(fā)其他系統(tǒng)疾病，預(yù)后較差。

2.2 肺炎克雷伯菌

肺炎克雷伯菌的菌株毒性較強，可感染社區(qū)中的健康人群并引起嚴重感染，如嚴重肺部感染、化膿性感染、腦膜炎等。隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，肺炎克雷伯菌能夠編碼并產(chǎn)生碳青霉烯酶，使其具有很高的耐藥性。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶β-內(nèi)酰胺酶是A 類絲氨酸碳青霉烯酶，是在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)的最常見的碳青霉烯酶。

2.3 大腸埃希菌

大腸埃希菌是存在于人類大腸的正常菌群。因機體免疫力低下、誤吸等原因?qū)е碌挠纱竽c埃希菌引起的感染很多，包括新生兒敗血癥或腦膜炎、腹瀉、尿路感染、肺部炎癥等。致病性大腸埃希菌菌株的致病機制包括黏膜部位的定植、宿主防御的逃避、繁殖和宿主損傷。大多數(shù)致病性大腸埃希菌菌株留在細胞外，但侵襲性大腸埃希菌能夠入侵上皮細胞和巨噬細胞并在細胞內(nèi)復(fù)制病原體。既往研究表明，中國65%的大腸埃希菌臨床分離株產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBL）。產(chǎn)生ESBL 的菌株對β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素具有耐藥性，并導(dǎo)致醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染。ESBL 可通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)促進耐藥基因在細菌中的傳播，導(dǎo)致嚴重的醫(yī)院感染。ESBL 的流行類型在不同地區(qū)并不相同，臨床上應(yīng)予以重視。

2.4 肺炎支原體及肺炎衣原體

肺炎支原體及肺炎衣原體均可引起非典型肺炎。支原體肺炎發(fā)病率較高的是兒童和年輕人，其典型的特點是發(fā)病緩慢、持續(xù)咳嗽。研究表明，在與哮喘相關(guān)的各種感染中，肺炎支原體與哮喘的嚴重程度和治療抵抗有關(guān)，并有可能在喘息性疾病中獨立發(fā)揮作用。肺炎衣原體作為一種能夠引起呼吸系統(tǒng)疾病的細胞內(nèi)病原體，還與心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)，關(guān)系比較密切的是動脈粥樣硬化，其與冠心病的發(fā)生風險呈正相關(guān)，因此，對存在心血管危險因素的易感人群應(yīng)予以重視。對肺炎支原體的實驗室診斷，通常同時使用抗體檢測和核酸擴增（通常是PCR）。各種檢測方法對病原體的確診存在局限性，應(yīng)將實驗室數(shù)據(jù)與臨床和（或）流行病學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合，為疾病診療提供幫助。

3 病原體流行特點

下呼吸道感染病原體分布在各國并不相同。地理區(qū)域、年齡、研究時期等不同因素會影響下呼吸道感染的發(fā)病情況。在成人中，呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、心血管疾病和慢性肝病是增加社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）風險的最常見合并癥。值得注意的是，男性患CAP 的風險高于女性，尤其是在重癥監(jiān)護病房，這可能與解剖結(jié)構(gòu)、行為、社會經(jīng)濟和生活方式的差異有關(guān)。在歐洲，CAP的年發(fā)病率估計為每1000人1.07～1.20例，在65 歲以上且男性居多的人群中可增加到每1000 人14 例。年齡因素對呼吸道感染有重要意義，其中30 歲以上人群受到支原體感染的機會大幅增加。有研究發(fā)現(xiàn)，從重癥肺部感染患者的痰標本中分離出的病原體以革蘭陰性菌為主，其中肺炎克雷伯菌占比最高（21.65%），該菌能夠長期存活于醫(yī)院內(nèi)各種環(huán)境中，當患者免疫力低下時感染，可引起交叉感染。感染了革蘭陰性桿菌的患者更容易感染耐甲氧西林葡萄球菌。而銅綠假單胞菌感染則更容易發(fā)生在患有支氣管擴張、囊性纖維化等嚴重結(jié)構(gòu)化疾病的患者中。此外，感染的嚴重程度、病原體類型存在地域差異。與美國相比，歐洲的肺炎球菌發(fā)生率更高。亞洲一項CAP 的綜合研究顯示，肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌是西方國家的常見病原體，亞洲地區(qū)則以金黃色葡萄球菌較為常見。

4 展望

盡管越來越多的抗生素在感染性疾病的治療中發(fā)揮重要作用，但下呼吸道感染仍是人類健康的巨大威脅。因地域、年齡、性別等因素的差別，病原體的種類、疾病的治療及預(yù)后各有不同。隨著抗生素的廣泛使用，病原體的耐藥性也逐年增加，因此，在合理應(yīng)用抗生素的同時，早期、準確、快速的檢測方法對疾病的預(yù)后具有重要意義。本文概述了近幾年應(yīng)用廣泛的病原體檢測方法，對下呼吸道感染相關(guān)病原體、流行病學(xué)特點等進行了總結(jié)，以期為下呼吸道感染的診斷、治療及流行病學(xué)調(diào)查提供借鑒。